聯苯芐唑乳膏體外經皮透過評價試驗

郜琪臻，劉 慧，趙亞囡，丁平田*

聯苯芐唑是一種新型的氮取代性不含鹵素的咪唑類局部抗真菌藥，該藥物抗菌譜廣、抗菌活性高、皮膚滲透力強、療效確切、作用持久、且毒性低［1］。本藥能很好地透過被感染的皮膚，作用迅速且持續時間長，維持時間超過48 h。由于真菌菌絲可侵入角質層深部，因此，抗真菌藥制劑的療效與其經皮滲透能力有關。本試驗以小型豬全皮皮膚為模型，應用改良的Franz立式擴散池，對受試聯苯芐唑進行了體外經皮透過評價。

1 實驗材料

1.1 儀器 透皮擴散試驗儀(TK-12B型)，上海鎧凱科技貿易有限公司;改良的Franz立式擴散池(有效透過面積3.14 cm2，接受池體積:7 mL，上海鎧凱科技貿易有限公司);HPLC色譜儀(SPD-10AVP)，日本島津;HPLC工作站，YL-clarity(韓國)。

1.2 材料 聯苯芐唑原料藥(重慶青陽藥業有限公司，批號:090505，含量99.1%;由濟南三源藥業有限公司提供);對照市售聯苯芐唑乳膏(拜耳醫藥保健有限公司，批號:BAT/115976);受試聯苯芐唑乳膏(濟南三源藥業有限公司，批號:20091027);生理鹽水注射液(黑龍江七臺河制藥廠，批號:081225101);其余試劑為市售色譜純。小型豬(巴馬香豬，雄性)，由重慶宗申醫達生物技術研發有限公司提供，動物生產許可證號:SCXK(渝)2010-0001。動物使用證:SYXK(渝)2010-0001。

2 方法與結果

2.1 離體皮膚的制備 將小型豬處死，機械法剪毛，剝取皮膚，切皮刀除去多余的脂肪組織，用生理鹽水洗干凈，放置冰箱(－70℃)中冷藏，備用。

2.2 色譜條件及系統適用性 色譜柱:Chromatorex C18(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流動相:0.08 mol/L三乙胺(用磷酸調pH值為7.0)∶乙腈∶甲醇 =15∶17∶68;流速:1.0 mL/min;柱溫:25 ℃;檢測波長:254 nm;進樣量:20 μL。

2.3 空白樣品的干擾試驗 取離體小型豬皮膚，按透皮試驗方法進行試驗，但是給藥池中不加藥物，以生理鹽水為接受液時，取試驗2、10 h的接受液;以PEG400∶生理鹽水(1∶2)為接受液時，取試驗2、10 h的接受液，過濾后進樣測定，HPLC圖譜見圖1～圖3。

圖1 生理鹽水為接受液時空白樣品10 h

圖2 PEG400∶生理鹽水(1∶2)為接受液時空白樣品10 h

圖3 聯苯芐唑標準品色譜峰

由圖3可見，聯苯芐唑保留時間為7.87 min，而空白樣品溶液在此保留時間無吸收，說明輔料不干擾聯苯芐唑測定。由圖3計算得到柱效為5 800，高于藥典規定的700，符合要求。

2.4 最低檢測限 采用企業提供的聯苯芐唑原料藥為工作對照品，精密稱取0.050 6 g(含量99.1%，相當于聯苯芐唑0.050 1 g)，加甲醇溶解稀釋成濃度為50 μg/mL的溶液，逐步稀釋，進樣測定，選取HPLC圖譜基線噪音3倍者作為最低檢測限，進樣濃度:0.001 μg/mL，最低檢測限 =0.001 μg/mL ×20 μL=2 ×10－5μg。

2.5 標準曲線的繪制 利用最低檢測限下配置的50 μg/mL聯苯芐唑對照品，用甲醇逐步稀釋配制成 1、5、10、25、40 μg/mL 的溶液。每一濃度進樣2次進行測定。以對照品的峰面積(A)對濃度(C)進行線性回歸，得回歸方程A=38.541 C+7.075 3(r=0.999 9)。結果，聯苯芐唑檢測濃度的線性范圍為1～40 μg/mL。濃度大于該范圍的樣品用接收介質稀釋后，進樣測定。

2.6 回收率試驗 用甲醇稀釋配制 5、25、50 μg/mL聯苯芐唑溶液，每種濃度分別配3份，按色譜條件每種濃度連續進樣3次，用標準曲線計算藥量，計算回收率，回收率在98% ～102%之間，見表1。

表1 回收率測定結果(n=9)

2.7 精密度試驗 回收率測定所用樣品溶液，每種濃度測定3次，計算高、中、低不同濃度的精密度，結果見表2。結果顯示精密度良好。

表2 精密度測定結果

2.8 穩定性試驗 取聯苯芐唑試驗樣品溶液(50.1 μg)，于室溫下放置，并于 0、2、3、4、5 h 按以上色譜條件進樣測定。結果顯示，聯苯芐唑峰面積無明顯變化，表明樣品溶液在5 h內基本穩定。見表3。

表3 樣品溶液穩定性試驗結果

2.9 體外經皮擴散試驗

2.9.1 接受介質的確定 在體外經皮試驗中，文獻中最常用的接受液是生理鹽水和磷酸鹽緩沖液(PBS)，理想的接受介質應當可以準確模擬被測化合物的體內經皮吸收條件。一般來說，在接受液中，藥物的濃度不能超過其飽和溶解度的10%(即應該滿足漏槽條件)，接受液濃度過高能導致吸收速率降低，進而導致過低估計了其在體吸收。一般認為，一個化合物在某水性溶液中的溶解度如果低于10 μg/mL，則不能用該溶液做接受液，有必要在接受介質中加入增溶劑［14］。

因為聯苯芐唑是難溶性藥物，因此，我們首先考察藥物在生理鹽水、丙二醇∶生理鹽水(1∶2)以及PEG400∶生理鹽水(1∶2)混合液中的溶解度，以確定接受介質。

稱取聯苯芐唑原料藥約1 g，至30 mL磨口三角瓶中，加入接受液25 mL，使溶液中始終保持有固體藥物存在，將此溶液置于37℃恒溫水浴中，100 rpm磁力攪拌，定時取樣1 mL，0.45 μm微孔濾膜濾過，棄去初濾液，取續濾液，進樣20 μL用HPLC測定含量，按標準曲線方程計算聯苯芐唑的濃度，超過標準曲線范圍的樣品，用各自接受介質稀釋后進樣測定。每種介質平行做2份試驗。分別測定3、5、10 h的溶解度，以確定所選的介質是否可以滿足漏槽條件。聯苯芐唑在PEG400∶生理鹽水(1∶2)混合液中溶解度稀釋20倍后進樣測定。見表4。

表4 聯苯芐唑在生理鹽水及丙二醇∶生理鹽水(1∶2)、PEG400∶生理鹽水(1∶2)混合液中溶解度(37℃，μg/mL)

由表4可見，聯苯芐唑在丙二醇∶生理鹽水(1∶2)混合液中溶解度約為2 μg/mL;在生理鹽水中的溶解度約為1 μg/mL;在PEG400∶生理鹽水(1∶2)混合液中約為 400 μg/mL(＞10 μg/mL)。由于聯苯芐唑在丙二醇∶生理鹽水(1∶2)混合液中溶解度很低，不符合漏槽條件，筆者選用生理鹽水和PEG400∶生理鹽水(1∶2)混合液作為透皮吸收的接受液，分別考察藥物的經皮透過性。

2.9.2 透皮試驗 采用改良的Franz立式擴散池進行試驗，本法是目前文獻中較常見的局部用制劑的體外透過性研究方法，一般認為是一種簡單、重現性好的試驗方法［2］。

擴散池由給藥池和接收池組成，將皮膚固定在供給池與接收池之間，將角質層面向給藥池一側，供給池中加入被測制劑(聯苯芐唑乳膏0.5 g)，輕輕涂抹，使乳劑均勻分布于皮膚上。接收池中加入7 mL的接受液，供給池底部凹槽中放入磁力攪拌子，攪拌速度100 rpm，溫度(37±0.5)℃。開始試驗后，于1、2、3、4、6、8、10 h 定時取樣，每次吸取2 mL接受液，隨即補等量的接受液，樣品溶液過濾后，利用HPLC測定藥物濃度。按分析方法項下色譜條件進樣，測得峰面積后，根據標準曲線計算濃度，再根據接受池液體積和有效擴散面積，按下面的公式計算單位面積(cm2)的累積透皮量(Qn)。

式中，Ci為第i點測得的藥物濃度(μg/mL);V為接受池液的總體積(7.0 mL);Vi為每次取樣的體積(2.0 mL);S為滲透面積(3.14 cm2)。受試聯苯芐唑乳膏和對照聯苯芐唑乳膏(市售)分別以生理鹽水、PEG400∶生理鹽水(1∶2)混合液為接受液測定經皮透過性。在生理鹽水接受液的條件下，對照聯苯芐唑乳膏樣品和受試樣品均不能透過離體的小型豬皮膚。在 PEG400∶生理鹽水(1∶2)接收液條件下有微量透過，試驗結果見表5～表8;可以看出，10 h的累積透過量受試聯苯芐唑乳膏為(0.286±0.100)μg/cm2，對照聯苯芐唑乳膏為(0.269±0.033)μg/cm2;二者經皮透過曲線基本一致，見圖4。所以，可以證明受試聯苯芐唑乳膏和對照聯苯芐唑乳膏在經皮透過性上沒有差異。

表5 受試聯苯芐唑乳膏經皮透過性測定結果［PEG400∶生理鹽水(1∶2)混合液為接受液，μg/mL］

表6 受試聯苯芐唑乳膏經皮累積透過量［PEG400∶生理鹽水(1∶2)混合液為接受液，μg/cm2］

表7 對照聯苯芐唑乳膏經皮透過性測定結果［PEG400∶生理鹽水(1∶2)混合液為接受液，μg/mL］

3 討論

中國藥典2005年版用甲醇∶水∶四氫呋喃(體積比為84∶5∶1)作測定乳膏中聯苯芐唑的流動相，并規定了理論塔板數不得低于700。實驗中發現采用這一流動相測定時，聯苯芐唑的最低檢測限0.01 μg(0.5 μg/mL ×20 μL)，不夠靈敏且色譜峰變寬。因此，本文本試驗參照文獻［3-6］，并經試驗確定，以pH7.0三乙胺磷酸鹽緩沖液∶乙腈∶甲醇(15∶17∶68)為流動相，采用ODSC18色譜柱，可有效減少ODS色譜柱硅醇基引起的藥物拖尾現象，而且測試時間相對較短。

表8 對照聯苯芐唑乳膏經皮累積透過量［PEG400∶生理鹽水(1∶2)混合液為接受液，μg/cm2］

圖4 聯苯芐唑乳膏經皮透過性測定曲線(PEG400∶生理鹽水(1∶2)混合液為接受液)

透皮實驗中，接受介質的確定是較關鍵的一步。在接受液中，藥物濃度應滿足漏槽條件。由于聯苯芐唑是難溶藥物，本實驗首先考察藥物在生理鹽水、丙二醇∶生理鹽水(1∶2)以及PEG400∶生理鹽水(1∶2)混合液中的溶解度，以確定接受介質。實驗時，注意使溶液中始終保持有固體藥物存在，即確保溶液達到飽和狀態。溶解度大的介質(PEG400∶生理鹽水(1∶2)混合液)可以滿足漏槽條件;雖然聯苯芐唑在生理鹽水中的溶解度很低，只有1 μg/mL左右，但是在透過性試驗中證明并沒有藥物透過，所以也符合漏槽條件，而且生理鹽水中因為沒有添加外來物質，更能代表在體的真實情況，因此，選擇這兩種介質合理可行。

［1］ 羅東輝，袁承晏.聯苯芐唑的藥效學研究實驗室抗真菌活性測定［J］.重慶醫科大學學報，1990，15(4):26.

［2］ 鄭俊民.經皮給藥新劑型［M］.第2版.北京:人民衛生出版社，2006:265.

［3］ 榮蓉，陳繼平，劉淑琴，等.聯苯芐唑乳膠劑的制備及質量考察［J］.中國藥劑學雜志，2008，6(5):219.

［4］ 王艷，徐暉，劉玉強，等.HPLC法測定乳膏中聯苯芐唑和醋酸曲安奈德的含量［J］.中國新藥雜志，2007，16(8):631.

［5］ 郭興杰，魏宗有，李發美.高效液相色譜法測定乳膏劑中的聯苯芐唑［J］.色譜，2001，19(3):289.

［6］ 張天虹，徐文，崔升淼，等.高效液相色譜法測定聯苯芐唑凝膠中聯苯芐唑的含量［J］.遼寧藥物與臨床，2003，6(4):174-175.