3'單肟靛玉紅的藥物代謝動力學研究

許利剛，張書剛，張仕林，張穎冬

上世紀70年代，中國醫學家們在傳統中成藥當歸蘆薈丸中發現，青黛的抗腫瘤有效成分是靛玉紅(Indirubin)，其對慢性粒細胞白血病的治療已經用于臨床［1-2］。靛玉紅的衍生物對其他腫瘤的抑制作用也正在研究中［3-5］。目前已經清楚，靛玉紅是一種選擇性的Cdks抑制劑，是Cdk1、Cdk2和Cdk5的競爭性抑制劑［6］，它可以在納摩爾水平抑制Cdk1、Cdk2和Cdk5的活性，但其水溶性和脂溶性都很差，且有一定的毒性。3'單肟靛玉紅(Indirubin-3'-monoxime，IMX)是其衍生物之一。IMX不僅具有Cdks抑制劑的基本特點，而且有較好的膜通透性，可以與ATP競爭Cdks激酶的催化位點［7］。體外試驗已經證實，其可以抑制引起tau蛋白過度磷酸化的GSK-3β和Cdk5/p25激酶活性。此外，在體外培養的小腦顆粒神經元上，IMX還可以通過劑量依賴性地抑制c-JunN末端蛋白激酶(JNK)減少細胞應激所致的凋亡［8］。此外，IMX可以抑制β淀粉樣蛋白對SH-SY5Y細胞的毒性［9］。在最近的 AD 小鼠動物模型中［10］也證實，IMX可以改善小鼠的記憶能力并且減輕β淀粉樣蛋白引起的病理學變化。IMX極有希望成為阻止AD進展的重要靶標。

鑒于Cdks抑制劑的研究已經從單純的抗腫瘤作用擴展到神經系統及其他系統疾病的治療，因此，對小分子Cdks抑制劑IMX相關藥代動力學研究很有必要。本文應用高效液相色譜法，通過測定不同給藥途徑鼠血漿中IMX濃度，得出IMX的相關藥代動力學參數，研究了IMX在鼠體內主要器官的分布，為進一步研究IMX在人體內藥代動力學過程及藥物的臨床應用提供了理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性SD大鼠，體質量(300±20)g，購自南京醫科大學實驗動物中心。實驗前均在衛生的環境中飼養，自由攝食、飲水。室溫(20±2)℃。

1.2 主要儀器設備 CS-15R臺式高速冷凍離心機:美國Beckman公司;Waters高效液相色譜:美國Waters公司;Waters 2487紫外檢測器:美國Waters公司;Breeze型色譜工作站:美國Waters公司;Waters1525 Binary HPLC Pump:美國Waters公司;754P分光光度計:上海光譜儀器有限公司;DY89-1電動勻漿機:寧波新芝科學儀器研究所。

1.3 藥品和試劑 IMX標準品，sigma公司購入，實驗前用DSMO溶解稀釋至所需濃度。

1.4 HPLC測定IMX的濃度

1.4.1 高效液相色譜(HPLC)條件 色譜柱為Hanbon-C18(5 μm，4.6 mm ×200 mm)，流動相為甲醇∶水(70∶30)，流速 1 mL/min，檢測波長365 nm，柱溫25 ℃，進樣量為20 μL。

1.4.2 大鼠血漿樣品的預處理［11］將每次收集的血樣0.2 mL置于1.5 mL的離心管中(內含1%的肝素 0.5 μL，80 ℃ 烘干)，2 500轉離心5 min，取上清液0.1 mL，加入0.2 mL乙腈，9 000轉離心10 min，上清液20 μL測IMX的濃度。

1.4.3 標準曲線的制作 精確稱IMX 10 mg，氯仿∶甲醇(1∶1)溶解，配制成濃度為1 mg/mL的貯備液(Ⅰ)。實驗前取貯備液(Ⅰ)1 mL用氯仿∶甲醇(1∶1)稀釋成濃度為10 μg/mL的貯備液(Ⅱ)。實驗時分別取大鼠新鮮血漿1 mL，依次加入貯備液(Ⅱ)，配成濃度為 0.1、0.3、0.6、1.0、2.0、3.0和4.0 μg/mL的系列標準溶液，按血樣處理的方法進行處理。按HPLC測定條件，分別測定IMX峰面積，繪制面積-濃度標準曲線，得到標準曲線方程A=a+b C。

1.4.4 回收率和精密度實驗 分別取0.2 mL大鼠新鮮血漿，加入 IMX溶液，使其濃度分別為0.6、2.0、4.0 μg/mL，按與血樣處理同法處理，HPLC測定回收率和日內、日間精密度。

1.4.5 大鼠血漿中IMX濃度的測定 分別取靜脈注射、腹腔注射后的血樣，按血樣處理方法處理，取20 μL用HPLC法分別測其峰面積，從標準曲線上查得濃度，繪制濃度-時間曲線。

1.5 IMX藥代動力學研究

1.5.1 靜脈給藥與采血方法 雄性SD大鼠10只，實驗前用乙醚麻醉，尾靜脈注射IMX 10 mg/kg(以DSMO為溶劑)，于注射IMX前及注射后2、5、10、15、20、30、45、60、90、120、180 和 240 min，分別由眼球后取血0.2 mL，置于肝素管中。

1.5.2 組織分布實驗 大鼠42只隨機分成7組，每組6只，一組處死取心、肺、腎、腦組織各2 g，按1∶1 加入生理鹽水，15 000 r/min 勻漿 1 min，高速離心(10 000 g)5 min，取上清液0.2 mL，加入乙腈0.4 mL，10 000轉離心10 min，上清液分別過膜，用HPLC法測定IMX濃度作為對照組。其他6組尾靜脈注射 IMX 溶液 10 mg/kg，于 0.5、1、2、3、4和5 h分別處死，取心、肺、腎、腦組織各2 g，按上述方法同樣處理，用HPLC法分別測定各組織中IMX的峰面積，應用上述標準曲線查得濃度，繪制濃度-時間曲線。

1.6 數據處理 血藥濃度-時間數據分別按照一室、二室、三室模型，運用Marquardt法迭代擬合，通過對模型擬合的評價，利用F檢驗法及根據AIC最小的原則選出最佳模型，采用中國藥理學會編3P87程序，計算藥代動力學參數。

2 結果

2.1 血藥濃度測定方法的確證

2.1.1 IMX的光譜特征 紫外光譜掃描結果顯示，IMX在365 nm處有一個吸收峰，所以選定365 nm作為檢測波長。按 HPLC法測定表明，IMX的保留時間為4.437 min(見圖1)。

圖1 大鼠血漿IMX色譜圖注:A.空白血漿，B.空白內標，C.IMX 10 mg/kg iv 10 min;1.IMX，2.solvent

2.1.2 標準曲線和線性范圍 HPLC測定IMX的線性范圍為0.14～4.0 μg/mL。標準曲線方程為 A=75.440 5 C-1.166 4，r=0.999 16。

2.1.3 回收率和精密度實驗 將回收率實驗樣品測定值代入標準曲線方程，計算出IMX濃度，以測定值與實際值之比計算回收率。0.6、2.0和4.0 μg/mL 3種濃度的日內平均相對回收率為99.05%、98.85%和97.12%。日內精密度RSD＜3%(n=5)，日間精密度RSD＜4%(n=5)，符合目前生物分析方法指導原則的要求。

2.2 IMX的藥時曲線和藥代動力學參數 大鼠尾靜脈注射IMX后，各時間點IMX的血藥濃度均在檢測范圍內，IMX的平均血藥濃度-時間曲線見圖2。用3P87藥代動力學軟件對IMX在大鼠體內的血藥濃度分別按照一室、二室、三室模型運用Marquardt法迭代擬合，對擬合結果進行比較，其中二室模型為最優模型。IMX的藥代動力學方程為C=1.37e-0.0731t+0.29e-0.0048t，藥代動力學參數見表1。

圖2 IMX平均血藥濃度-時間曲線

表1 靜脈給與IMX 10 mg/kg的藥物動力學參數

2.3 組織分布研究 大鼠尾靜脈注射IMX后，IMX在各組織中的平均濃度-時間曲線見圖3。IMX在肺組織中的分布0.5 h達高峰，而后降低;IMX在腦中的分布0.5 h達高峰，而后逐漸降低;IMX在心臟組織中的含量較高，1 h達到高峰，而后逐漸降低;IMX在腎臟組織中的分布顯示，在3 h達高峰，而后迅速降低。

圖3 3'單肟靛玉紅10 mg/kg靜脈給藥后的組織分布

3 討論

本研究方法采用甲醇∶水(70∶30)作為流動相，用HPLC-UV法測定大鼠血漿中IMX的濃度，血漿中的內源性物質不干擾IMX的測定，IMX的保留時間為4.437 min，操作省時、簡便、精密度及重現性均較好。

尾靜脈注射IMX后，大鼠尾靜脈注射IMX后的藥代動力學過程用開放的二室模型來描述較為合理。T1/2α為 9.70 min，α 為 0.073/min，β 為0.004 8/min，T1/2β為 129.26 min，遠大于 T1/2α，說明IMX在體內以消除過程為主。K12大于K21，說明IMX從中央房室向外周房室轉運速率大于從外周房室向中央房室的轉運速率。穩態表觀分布容積 Vss［=VC(1+K12/K21)］為 35.807 L/kg，中央室表觀分布容積VC為9.605 L/kg，中央室表觀分布容積占總表觀分布容積的29.27%，說明藥物主要分布在體循環和血流豐富的組織中。一方面可能由于IMX屬脂溶性物質，易溶于有機組織;另一方面，可能是IMX在大鼠體內經過肝臟的首關消除轉化為其他物質，因而在血漿中測定的濃度較低，其原因有待進一步研究。

藥物進入血液從血流向中樞神經系統分布，主要在藥物進入細胞間隙和腦脊液時受到限制。腦組織的毛細血管內皮細胞緊密相連，不具有多數組織毛細血管內皮組織之間的小孔和吞飲小泡，而且外表面幾乎全為星形膠質細胞包圍。這種結構特點，使得某些大分子、脂溶性差或解離度大的藥物難于進入腦組織。藥物能否進入腦組織，取決于藥物的脂溶性和解離度［12］。根據IMX的化學結構特點，其脂溶性高，解離度小，較易進入腦組織。大鼠尾靜脈注射IMX后，IMX在腦中的分布0.5 h達高峰，而后逐漸降低，說明IMX進入腦組織時，易于透過血腦屏障，可能以被動擴散為主，需要進一步研究加以證實。大鼠靜脈注射IMX后，IMX在大鼠的肺、心臟、腎臟組織中的分布結果顯示，IMX在肺組織中的分布0.5 h達高峰，而后降低;IMX在心臟組織中的含量較高，1 h達到高峰，而后逐漸降低;IMX在腎臟組織中的分布顯示，在3 h達高峰，而后迅速降低。通過研究IMX在大鼠體內的藥代動力學過程及其在大鼠體內的分布，為IMX的臨床應用提供了重要依據，但在不同種屬動物體內的藥物代謝過程以及病理情況下的藥物代謝過程還有待進一步研究。

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