多巴胺D3受體對大鼠腎臟近曲小管上皮細胞多巴胺D4受體表達和功能的影響*

陳新建，楊劍，任紅梅，陳彩宇，何多芬，王旭開，王紅勇，楊成明，周林，曾春雨

腎臟是人體負責尿鈉排泄的重要器官，它通過對尿鈉重吸收的調節在血壓調節中發揮重要的作用，其中多巴胺及其受體的作用尤為重要［1］。多巴胺受體按其結構和藥理特性不同分為兩大類，即D1類受體(D1、D5)和 D2類受體(D2、D3、D4)，所有多巴胺受體都直接或間接參與腎臟的尿鈉排泄和血壓的調控［2］。D3、D4受體均為D2類受體，對腎臟尿鈉排泄及機體血壓調控發揮重要作用。我們前期研究表明多巴胺受體亞型之間具有相互作用:刺激Wistar-Kyoto(WKY)大鼠腎臟近曲小管(RPT)上皮細胞的D3受體能夠影響D1、D5受體表達及其介導的生理功能［3，4］。但是，D3受體對同為多巴胺D2類受體的D4受體是否具有作用目前還不清楚。本實驗利用WKY大鼠的RPT上皮細胞株為研究對象，觀察D3受體激動劑作用后對D4受體表達與功能的影響。

1 材料與方法

材料:RPT細胞株于2003-06由美國Georetown大學Dr.Pedro.Jose實驗室提供，來源于4～8周的WKY大鼠，既往實驗證實其與活體 RPT具有相同的特性［5，6］;胎牛血清與 DMEM/F12 培養基購至美國 Gibco公司;D3受體激動劑(PDl28907)、D3受體特異性抑制劑(U99194A)，D4受體激動劑(PD168077)、磷脂酶C抑制劑(U73122)均購自美國Sigma公司;D4受體抗體為羊抗多克隆抗體，購自美國Santa Cruz公司。

細胞培養:RPT上皮細胞在含有95%空氣和5%二氧化碳的培養箱培養，所用培養基為DMEM/F12培養基(含10%胎牛血清)。待細胞長至80% ～90%融合狀態用0.25%胰酶消化、傳代。

免疫印跡:藥物干預后的細胞經過常規方法提取蛋白，測定蛋白濃度。等量總蛋白進行SDS-PAGE電泳，半干轉移法將蛋白轉移至聚偏(二)氟乙烯膜上，室溫封閉4 h，然后與D4受體抗體(稀釋濃度為1∶400)作用，4℃孵育過夜，二抗(稀釋濃度為1∶5000)室溫孵育1 h，采用Super Signal(美國Pierce公司)顯色發光。免疫印跡結果用α-肌動蛋白(α-actin)進行校正。

細胞膜的制備:將所選細胞用D3受體激動劑PDl28907刺激24 h后，洗去D3受體激動劑PDl28907，再用10－7mol/L D4受體激動劑PD168077刺激細胞15 min，測定D4受體激動劑PD168077對RPT上皮細胞的Na+-K+-ATP酶(ATP為三磷酸腺苷)活性的影響(與單獨D4受體激動劑PD168077作用相比)。細胞膜懸液采用等滲、低溫高速離心法進行制備。

Na+-K+-ATP酶活性測定:酶活性測定采用哇巴因法，鉬酸銨硫酸亞鐵顯色定磷后，740 nm處比色，用分光光度法測定產生的無機磷含量，其中無哇巴因存在下產生的無機磷為總ATP酶活性，有哇巴因存在下產生的為Mg+-ATP酶，兩者之差為Na+-K+-ATP酶活性。其中，以對照活性為100%。

統計學方法:計量資料以平均數士標準差表示，兩組以上的比較采用ANOVA法進行統計分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 D3受體激動劑PDl28907對Wistar-Kyoto大鼠腎臟近曲小管上皮細胞D4受體表達的影響

利用不同濃度D3受體激動劑PD128907(10－10～10－6mol/L)作用RPT上皮細胞24 h，結果發現D3受體激動劑PD128907能夠有效增強RPT上皮細胞中D4受體蛋白表達，該作用呈現濃度依賴性關系，10－9～10－6mol/L與對照(不加任何藥)比差異均有統計學意義(P＜0.05)。(圖1)

利用D3受體激動劑PD128907(10－7mol/L)分別刺激 RPT 上皮細胞不同時間(4 h、8 h、16 h、24 h、30 h)，結果發現D3受體激動劑PD128907對RPT上皮細胞中D4受體蛋白表達的影響也呈現時間依賴性關系，4 h、8 h、16 h、24 h、30 h 與對照(0 h)比差異均有統計學意義(P＜0.05)。(圖2)

預先用D3受體抑制劑U99194 A(10－6mol/L)共刺激作用下，發現 D3受體激動劑 PD128907(10－7mol/L)對D4受體蛋白表達的促進作用受到阻斷，單獨的D3受體抑制劑U99194 A對D4受體蛋白表達與對照(不加任何藥)比沒有變化。單獨的D3受體激動劑PD128907(10－7mol/L)對D4受體蛋白表達均高于對照(不加任何藥)、單獨U99194 A及PD128907+U99194 A，差異均有統計學意義(P＜0.05)。(圖3)

利用磷脂酶C抑制劑U73122(10－7mol/L)預先孵育細胞，再與D3受體激動劑PD128907(10－7mol/L)單獨或共刺激RPT上皮細胞。結果發現在磷脂酶C抑制劑 U73122存在的情況下，D3受體激動劑PD128907刺激D3受體后對D4受體的促進表達效應受到顯著抑制。單獨的 D3受體激動劑 PD128907(10－7mol/L)對D4受體蛋白表達均高于對照(不加任何藥)、單獨U73122及PD128907+U73122，差異均有統計學意義(P＜0.05)。(圖4)

圖1 不同濃度D3受體激動劑PDl28907(10－10～10－6mol/L)對D4受體蛋白表達的影響。與對照比*P＜0.05，n=5

圖2 D3受體激動劑PDl28907(10－7mol/L)不同作用時間對D4受體蛋白表達的影響。與對照比*P＜0.05，n=5

圖3 被D3受體抑制劑U99194A刺激后，D3受體激動劑PD128907(10－7mol/L)對D4受體蛋白表達的影響。與其它3項比*P ＜0.05，n=8

圖4 被磷脂酶C抑制劑(U73122，10－7mol/L)刺激后，D3受體激動劑PD128907(10－7mol/L)對D4受體蛋白的影響。與其它3項比*P＜0.05，n=8

2.2 D3受體激動劑PD168077對腎臟近曲小管上皮細胞中D4受體介導的Na+-K+-ATP酶活性抑制功能的影響

單獨的D4受體激動劑PD168077刺激細胞15 min后，Na+-K+-ATP酶的活性為77%，與對照100%比較明顯受到抑制(P＜0.05，n=5);利用D3受體激動劑PD128907(10－7mol/L)刺激24小時后，再用D4受體激動劑PD168077刺激D4受體，則使得Na+-K+-ATP酶活性進一步降低為62%，與對照100%比較差異有統計學意義(P ＜0.05，n=5)。

3 討論

腎臟是人體負責尿鈉排泄的主要器官，它通過對尿鈉重吸收的調控作用在血壓調節中發揮重要的作用，其中多巴胺及其受體的作用尤為重要。RPT是多巴胺分泌的部位，也是主要的作用部位，當體內鈉負荷過載時，多巴胺通過抑制RPT對尿鈉的重吸收，在腎臟尿鈉排泄中發揮重要作用［7，8］。多巴胺受體根據結構和藥理學特性不同分為D1類(D1和D5)受體和D2類(D2，D3，D4)受體［9］。以往研究大多集中于多巴胺D1類受體，對多巴胺D2類受體研究較少。不過，近年來的研究表明，屬于多巴胺D2類受體的多巴胺D3與D4受體在腎臟尿鈉排泄中均具有重要作用。

D3受體與D4受體均為多巴胺D2類受體中的亞型之一，在腎臟中的近曲小管、遠曲小管、皮質集合管、腎小球以及腎臟血管等均有表達，這兩種多巴胺受體亞型均對腎臟尿鈉排泄具有促進作用［10，11］。研究發現D3受體突變小鼠(D3-/-)與 D4受體突變小鼠(D4-/-)的血壓也均明顯高于野生型小鼠［12，13］。同時，我們前期研究也發現了在WKY大鼠腎臟中，刺激D3受體可明顯增加D3/Ga12受體及D3/Ga13受體之間的連接程度，這將有利于腎臟尿鈉排泄［14］;在WKY的RPT細胞中，刺激D3受體可顯著抑制血管緊張素1型受體(AT1受體)的表達，這也有利于抑制血管緊張素1型受體介導的尿鈉潴留作用［15］。既往研究發現，在多巴胺D1類和D3類受體之間存在協同作用，刺激RPT細胞的D3受體能夠影響D1、D5受體表達及其介導的生理功能［3，4］。但是，同屬于多巴胺D2類受體的D3受體與D4受體是否也具有相互作用并不清楚。我們在本研究中發現，利用D3受體激動劑PD128907作用于WKY大鼠的RPT上皮細胞可以顯著促進D4受體的表達，提示D3受體可能通過影響D4受體的表達從而影響D4受體介導的生理學功能。

在以往研究中，我們已經發現 D4受體激動劑PD168077作用WKY的RPT細胞后，可以明顯抑制RPT細胞的Na+-K+-ATP酶活性，從而抑制腎小管尿鈉重吸收，有利于腎臟尿鈉排泄［10］。因此，我們在發現D3受體增強D4受體的表達后繼續研究了該效應是否影響了D4受體介導的尿鈉排泄功能。結果發現，相對于單獨刺激D4受體的作用而言，在D3受體預先刺激24小時的情況下，D4受體激動劑PD168077對RPT上皮細胞的Na+-K+-ATP酶活性的抑制作用有所增強，提示D3受體對D4受體介導的對Na+-K+-ATP酶活性的抑制效應同樣具有促進作用。這進一步說明D3受體在RPT可以通過改變D4受體表達，進而對D4受體功能產生影響，從而改變D4受體介導的促尿鈉排泄功能。

研究發現磷脂酶C在多巴胺受體介導的多個信號途徑中發揮了重要作用。多巴胺D1類受體激動劑在哺乳動物腦部可以通過磷脂酶C信號從而在磷酸肌醇信號途徑中發揮作用［16］。多巴胺D1與D2受體共刺激后可以通過磷脂酶C途徑及其下游鈣離子信號通路從而在受體功能上發生相互關聯［17］。因此，我們推測D3受體很可能也通過磷脂酶C信號途徑增強D4受體的表達及其介導的生理功能。我們預先使用磷脂酶C抑制劑U73122作用RPT上皮細胞后，發現D3受體激動劑PD128907促進D4受體表達的效應作用受到明顯抑制，提示在WKY的RPT上皮細胞中D3受體對D4受體的增強作用可能與磷脂酶C信號途徑有關。

綜上所述，刺激D3受體可以促進D4受體表達及其介導的促尿鈉排泄功能而發揮對血壓的調控作用，該作用可能通過磷脂酶C信號途徑完成。

［1］Banday AA，Lokhandwala MF.Dopamine receptors and hypertension.Curr Hypertens Rep，2008，10(4):268-275.

［2］Zeng C，Armando I，Luo Y，et al.Dysregulation of dopaminedependent mechanisms as a determinant of hypertension:studies in dopamine receptor knockout mice.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2008，294(2):H551-H569.

［3］Zeng C，Wang Z，Li H，et al.D3dopamine receptor directly interacts with D1dopamine receptor in immortalized renal proximal tubule cells.Hypertension，2006，47(3):573-579.

［4］黃河飛，何多芬，石偉彬，等.多巴胺D3受體對腎臟近曲小管上皮細胞D5受體的影響在高血壓發生中的作用.中華高血壓雜志，2008，16(9):802-806.

［5］Zeng C，Liu Y，Wang Z，et al.Activation of D3dopamine receptor decreases AT1 angiotensin receptor expression in rat renal proximal tubule cells.Circ Res，2006，99:494-500.

［6］Zeng C，Yang Z，Wang Z，et al.Interaction of ATl and D5dopamine receptors in renal pro-ximal tubule cells.Hypertension，2005，45:804-810.

［7］Zeng C，Zhang M，Asico LD，et al.The dopaminergic system in hypertension.Clin Sci(Lond)，2007，112(12):583-597.

［8］Jose PA，Eisner GM，Felder RA.Regulation of blood pressure by dopamine receptors.Nephron Physiol，2003，95(2):19-27.

［9］Zeng C，Sanada H，Watanabe H，et al.Functional genomics of the dopaminergic system in hypertension.Physiol Genomics，2004，19(3):233-246.

［10］何多芬，楊劍，周林，等.多巴胺D4受體對腎臟近曲小管上皮細胞Na+-K+-ATP酶活性的影響.中華高血壓雜志，2009，17(12):1095-1098.

［11］Staudacher T，Pech B，Tappe M，et al.Arterial blood pressure and renal sodium excretion in dopamine D3receptor knockout mice.Hypertens Res，2007，30(1):93-101.

［12］曾春雨，楊志偉，吳麗娟，等.D3多巴胺受體基因敲除小鼠高血壓產生機制的探討.中華心血管病雜志，2005，33(12):1132-1136.

［13］Wang X，Villar VA，Armando I，et al.Dopamine，kidney，and hypertension:studies in dopamine receptor knockout mice.Pediatr Nephrol，2008，23(12):2131-2146.

［14］楊劍，于長青，石偉彬，等.多巴胺D3受體激動劑對腎臟G蛋白亞基Ga12、Ga13與D3受體偶聯的影響.中華高血壓雜志，2008，16(9):907-911.

［15］Zeng C，Liu Y，Wang Z，et al.Activation of D3dopamine receptor decreases AT1angiotensin receptor expression in rat renal proximal tubule cells.Circ Res，2006，99(5):494-500.

［16］Sahu A，Tyeryar KR，Vongtau HO，et al.D5dopamine receptors are required fordopaminergic activation ofphospholipase C.Mol Pharmacol，2009，75(3):447-453.

［17］Lee SP，So CH，Rashid AJ，et al.Dopamine D1and D2receptor Coactivation generates a novel phospholipase C-mediated calcium signal.J Biol Chem，2004，279(34):35671-35678.