RP-HPLC法測定人血漿中丙泊酚的濃度

張惠君，王彥，唐芳麗（1.天津第三醫(yī)院，天津市 0050；.天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院，天津市 0005；.天津醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系，天津市 0085）

丙泊酚（Propofol，異丙酚）化學(xué)名為2，6-二異丙基苯酚，是一種新型快速短效靜脈全身麻醉藥，具有起效快、復(fù)蘇迅速、持續(xù)時(shí)間短、蘇醒后患者意識清晰、無嗜睡、無眩暈、劑量易于掌握等特點(diǎn)，自20世紀(jì)80年代問世以來，被廣泛用于麻醉誘導(dǎo)、麻醉維持、麻醉中、手術(shù)后與重癥監(jiān)護(hù)病房（ICU）的鎮(zhèn)靜，成為全球用量最大的靜脈麻醉藥。丙泊酚的血藥濃度與藥效之間有密切的關(guān)系，通過監(jiān)測其血藥濃度，可以調(diào)整給藥劑量和速度，達(dá)到理想的麻醉深度，指導(dǎo)臨床合理用藥。目前，文獻(xiàn)報(bào)道的丙泊酚血藥濃度檢測方法有熒光光譜法[1]、高效液相（HPLC）-紫外檢測法[2]、HPLC-熒光檢測法[3]、氣相色譜（GC）法[4]和氣-質(zhì)聯(lián)用（GC-MS）法[5]。后2種方法靈敏度較高，所需的樣品量少，但儀器設(shè)備較昂貴，不易推廣；而HPLC-紫外檢測器在日常工作中應(yīng)用廣泛。因此，筆者參考有關(guān)文獻(xiàn)[2，3]，對文獻(xiàn)報(bào)道的HPLC-紫外檢測法作了一些改進(jìn)，為科研及臨床手術(shù)中丙泊酚血藥濃度的監(jiān)測提供了一種更為準(zhǔn)確、靈敏、快速的檢測方法。

1 材料

1.1 儀器

UltiMate3000高效液相色譜儀，包括UltiMate3000二極管陣列檢測器、UltiMate 3000二元泵、Dionex Chemeleon色譜工作站（美國戴安公司）；CP225D電子分析天平（德國賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；YKH-Ⅲ液體快速混合器（江西醫(yī)療器械廠）；800型離心沉淀器（上海手術(shù)器械廠）；LD5-2A型離心機(jī)（北京醫(yī)用離心機(jī)廠）；舒美KQ218超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；SHB-ⅢA循環(huán)水式多用真空泵（陜西太康生物科技有限公司）。

1.2 試藥

丙泊酚標(biāo)準(zhǔn)品（中國藥品生物制品檢定所，批號：100806-200801，純度：99.8%）；乙腈為色譜純，麝香草酚、磷酸二氫鉀、高氯酸、磷酸、鹽酸均為分析純，水為天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院制劑室提供的雙重蒸餾水。健康人全血由天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院中心血站提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Kromasil C18烷基鍵合硅膠柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.01 mol·L－1磷酸二氫鉀水溶液（70∶30，磷酸調(diào)節(jié)pH值至4.0）；內(nèi)標(biāo)：麝香草酚；柱溫：室溫；紫外檢測波長：270 nm；流速：1.0 mL·min－1；靈敏度：0.001 AUFS；進(jìn)樣量：20 μL。

2.2 試驗(yàn)溶液的制備

2.2.1 丙泊酚標(biāo)準(zhǔn)貯備液：準(zhǔn)確稱取丙泊酚標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，置于100 mL容量瓶中，用乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為0.1 mg·mL－1的丙泊酚標(biāo)準(zhǔn)貯備液，置4℃冰箱保存。

2.2.2 丙泊酚標(biāo)準(zhǔn)稀釋液：精密量取0.1 mg·mL－1的丙泊酚標(biāo)準(zhǔn)貯備液1 mL，置于10 mL容量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為10 μg·mL－1的丙泊酚標(biāo)準(zhǔn)稀釋液，置4 ℃冰箱保存。

2.2.3 丙泊酚標(biāo)準(zhǔn)工作液：精密量取10 μg·mL－1的丙泊酚標(biāo)準(zhǔn)稀釋液1 mL，用流動(dòng)相定容于10 mL容量瓶中，搖勻，即得濃度為1 μg·mL－1的丙泊酚標(biāo)準(zhǔn)工作液，置4℃冰箱保存。

2.2.4 麝香草酚標(biāo)準(zhǔn)貯備液：準(zhǔn)確稱取麝香草酚5.0 g，置于50 mL容量瓶中，用乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為0.1 mg·mL－1的麝香草酚標(biāo)準(zhǔn)貯備液，置4℃冰箱保存。

2.2.5 麝香草酚內(nèi)標(biāo)工作液：精密量取0.1 mg·mL－1的麝香草酚標(biāo)準(zhǔn)貯備液1 mL，用流動(dòng)相定容于10 mL容量瓶中，搖勻，即得濃度為10 μg·mL－1的麝香草酚內(nèi)標(biāo)工作液，置4℃冰箱保存。

2.3 血漿樣品處理

取經(jīng)肝素抗凝的健康人全血適量至試管中，3000 r·min－1離心10 min，分離得到血漿樣品。精密吸取空白血漿200 μL，置于10 mL具塞試管中，加入10 μg·mL－1的麝香草酚內(nèi)標(biāo)工作液200 μL，1%鹽酸溶液2滴，渦旋混合2 min，靜置30 min，加6%高氯酸乙腈溶液200 μL，渦旋混合15 min，6000 r·min－1離心30 min，取上清液置另一試管中。再加6%高氯酸乙腈溶液100 μL，渦旋混合10 min，6000 r·min－1離心10 min，合并2次上清液充分混合，取20 μL進(jìn)樣，作HPLC分析。

2.4 干擾試驗(yàn)

取空白血漿200 μL，按“2.3”項(xiàng)下方法處理，進(jìn)樣。由所得色譜圖可知，在丙泊酚與麝香草酚的相應(yīng)位置無干擾峰出現(xiàn)（色譜見圖1A）。

2.5 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

取一定濃度丙泊酚與麝香草酚的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液20 μL，重復(fù)進(jìn)樣5次，記錄色譜圖（色譜見圖1B、C）。由圖1可見，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下，血漿中內(nèi)源性雜質(zhì)不干擾丙泊酚的測定，丙泊酚與內(nèi)標(biāo)峰無重疊，兩者分離度＞1.5，麝香草酚與丙泊酚的理論塔板數(shù)均＞17000；保留時(shí)間分別為6.5、10.6 min；拖尾因子均在0.95～1.05范圍內(nèi)，符合2005年版《中國藥典》的有關(guān)規(guī)定[6]。

2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密吸取空白血漿200 μL共6份，分別精密加入丙泊酚標(biāo)準(zhǔn)工作液20、100、200 μL以及丙泊酚標(biāo)準(zhǔn)稀釋液100、200、300 μL，配成濃度分別為0.1、0.5、1、5、10、15 μg·mL－1的系列丙泊酚血漿溶液，再依次加入內(nèi)標(biāo)工作液200 μL、1%鹽酸2滴，依照“2.3”項(xiàng)下方法操作測定，記錄色譜。以丙泊酚峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值（Ai/As）對丙泊酚血漿濃度（c）進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：Ai/As＝0.0749 c+0.0054（r＝0.9999，n＝5）。結(jié)果表明，丙泊酚血藥濃度在0.1～15 μg·mL－1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖1 高效液相色譜圖A.空白血漿；B.丙泊酚標(biāo)準(zhǔn)溶液+內(nèi)標(biāo)工作液；C.血漿樣品+內(nèi)標(biāo)工作液；1.麝香草酚；2.丙泊酚Fig 1 HPLC chromatogramsA.blank plasma；B propofol standard solution+thymol；C.plasma sample+thymol；1.thymol；2.propofol

2.7 回收率試驗(yàn)

2.7.1 提取回收率：取健康人空白血漿200 μL，分別精密加入丙泊酚標(biāo)準(zhǔn)稀釋液 100、200、300 μL，制成濃度分別為 5.0、10.0、15.0 μg·mL－1的血漿樣品，每種濃度各3份，按“2.3”項(xiàng)下方法操作，進(jìn)樣20 μL，測定峰面積，其結(jié)果與乙腈直接配制的同濃度的丙泊酚和內(nèi)標(biāo)的混合對照液直接進(jìn)樣所測得的峰面積相比，計(jì)算提取回收率。結(jié)果，丙泊酚低、中、高3種濃度的平均提取回收率為89.46%（n＝9），詳見表1。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果（±s ，n＝3）Tab 1 Results of recovery tests（±s ，n＝3）

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果（±s ，n＝3）Tab 1 Results of recovery tests（±s ，n＝3）

濃度/μg·mL-1 5.010.015.0 RSD/%0.240.960.39平均提取回收率/%88.22±4.90188.07±7.80692.08±6.780 RSD/%5.68.87.4平均方法回收率/%99.07±0.24099.48±0.954100.31±0.386

2.7.2 方法回收率：按“2.6”項(xiàng)下方法配制濃度分別為5.0、10.0、15.0 μg·mL－1的血漿樣品各3 份，依照“2.3”項(xiàng)下方法操作，同法測定，記錄峰面積。將丙泊酚與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值代入血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算得丙泊酚的測定濃度，以丙泊酚的測定濃度與理論濃度的比值為方法回收率。結(jié)果，丙泊酚低、中、高3種濃度的平均方法回收率為99.62%（n＝9），詳見表1。

2.8 精密度試驗(yàn)

取空白血漿200 μL 3份，分別精密加入丙泊酚標(biāo)準(zhǔn)工作液200 μL以及丙泊酚標(biāo)準(zhǔn)稀釋液100、300 μL，配成濃度分別為1、5、15 μg·mL－1的丙泊酚血漿樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法操作，測定峰面積，每種濃度日內(nèi)平行測定5次，計(jì)算日內(nèi)精密度；3種濃度每天各測定1次，連續(xù)5 d，計(jì)算日間精密度，精密度試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 精密度試驗(yàn)結(jié)果（±s ，n＝5）Tab 2 Results of precision tests（±s ，n＝5）

表2 精密度試驗(yàn)結(jié)果（±s ，n＝5）Tab 2 Results of precision tests（±s ，n＝5）

濃度/μg·mL-1 1.05.015.0 RSD/%5.505.606.60日間精密度峰面積比值0.0366±0.002720.1729±0.019000.4534±0.01867 RSD/%7.4310.904.12日內(nèi)精密度峰面積比值0.0383±0.002110.1906±0.010760.46208±0.03079

2.9 最低檢測限

含藥血漿樣品以色譜峰高相當(dāng)于儀器基線噪音比3倍量進(jìn)行測定，結(jié)果丙泊酚的最低檢測限為0.10 μg·mL－1。

2.10 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取低、中、高3種濃度血漿樣品，在4℃條件下分別保存1、5、10、20 d及室溫放置3 h后，按“2.3”項(xiàng)下方法操作并進(jìn)行HPLC分析，結(jié)果血漿中丙泊酚的含量無明顯的改變。

3 討論

文獻(xiàn)報(bào)道提取血液中丙泊酚的方法主要有萃取法和沉淀法，本試驗(yàn)對2種方法進(jìn)行了比較。在萃取法中采用環(huán)己烷為萃取劑、四甲基氫氧化銨為穩(wěn)定劑，以氮?dú)獯蹈捎袡C(jī)層，流動(dòng)相復(fù)溶后進(jìn)樣測定。結(jié)果表明這種方法操作煩瑣費(fèi)時(shí)，在吹干過程中藥物易揮發(fā)，導(dǎo)致提取量與丙泊酚濃度之間不能呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，提取回收率不穩(wěn)定，且有機(jī)溶劑對測定有干擾，從而影響定量分析。在沉淀法中采用6%高氯酸乙腈溶液為沉淀劑進(jìn)行2次提取、渦旋混合、離心后進(jìn)樣分析。結(jié)果顯示沉淀法較萃取法操作簡單快速、方法的線性關(guān)系較好、穩(wěn)定性好、準(zhǔn)確性高，適宜于臨床上血藥濃度的監(jiān)測。

丙泊酚是弱酸性物質(zhì)，流動(dòng)相組分的比例及其酸堿度直接影響丙泊酚的色譜行為，經(jīng)多次試驗(yàn)證實(shí)以乙腈-0.01 mol·mL－1磷酸二氫鉀水溶液（70∶30）為流動(dòng)相，磷酸調(diào)節(jié)pH值至4.0時(shí)，麝香草酚和丙泊酚有較好的分離度，血漿的內(nèi)源性物質(zhì)及試劑對測定無干擾。

配制一定濃度的丙泊酚標(biāo)準(zhǔn)溶液，以流動(dòng)相為空白，在200～400 nm波長范圍內(nèi)掃描。結(jié)果丙泊酚在270 nm波長處有最大吸收，因此選擇該波長為測定波長。

[1]路麗華，張 惠，高 蓉，等.熒光檢測異丙酚血藥濃度[J].第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，26（11）：86.

[2]徐 萍，房志仲，婁建石.高效液相色譜法測定人血清中丙泊酚含量[J].天津藥學(xué)，2009，21（2）：22.

[3]范瑩盈，徐禮鮮，文愛東，等.改良反相高效液相色譜法測定血清中異丙酚濃度[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，26（10）：1510.

[4]李慶民，潘 陽.丙泊酚的GC法測定[J].中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，2000，31（8）：71.

[5]鄭 宏，曹興華，王 江，等.氣相色譜-質(zhì)譜法測定異丙酚的血藥濃度[J].中華麻醉學(xué)雜志，2004，24（1）：71.

[6]國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典（二部）[S].2005年版.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：附錄29.