關節腔內注射醫用臭氧對兔膝骨性關節炎的影響及最佳濃度探討

庾俊雄，徐 恒，譚永星，鄒國耀

(桂林醫學院附屬醫院，廣西桂林 541001)

膝骨性關節炎(OA)是中老年人常見病，目前臨床多以藥物和物理療法治療，且效果多不滿意[1]。臭氧具有較強的消炎、止痛作用，有資料表明關節腔內注射臭氧對 OA有治療作用[2]。2010年，我們觀察了醫用臭氧對 OA關節軟骨及關節液中 NO的影響，探討其治療膝骨性關節炎的最佳濃度。

1 材料與方法

1.1 材料 6～8個月齡健康大耳白兔 32只，雌雄不拘，體質量 2.0～2.5 kg。隨機分為空氣組及臭氧低、中、高劑量組各 8只。各組分籠飼養 1周適應環境后進行實驗。一氧化氮(NO)測定試劑盒由南京建成生物工程研究所生產，醫用臭氧發生器，為德國赫爾曼公司產品。

1.2 OA模型的建立及干預 每組右膝關節均按Hulth法[3]復制出膝骨性關節炎(OA)模型:麻醉后，從膝關節內側切斷兔右膝關節內側副韌帶和前后交叉韌帶，切除內側半月板，縫合關節囊及皮膚。自造模日起，每日上午驅趕動物活動 15 min，共 4周;左膝關節作為對照。4周后空氣組右膝關節腔內注入空氣 2 ml，臭氧低、中、高劑量組分別予膝關節腔內注射 25、40、80 μg/ml醫用臭氧 2 ml，1次/周 ，共 4周 。

1.3 相關指標檢測 ①膝關節活動度 :分別于造模前、造模成功后及處死動物前采用量角器測量膝關節屈伸最大角度，每膝關節測量 3次，取其平均值。②關節軟骨病理改變:治療完成 3 d后將動物麻醉后固定，抽取 1 ml生理鹽水注入右膝關節腔，充分活動膝關節后抽出關節腔內液體、暴露膝關節腔，大體觀察股骨髁和脛骨平臺，于股骨髁內側小心取軟骨組織 3 mm×3 mm，厚約 0.5 mm，置入 10%中性甲醛溶液內固定，石蠟包埋。肉眼觀察關節軟骨色澤、表面光滑度、纖維化、糜爛潰瘍或骨贅形成發生情況;HE染色觀察關節軟骨表面是否規則、潮線是否完整、軟骨細胞排列是否規則、軟骨細胞數量、軟骨表層纖維性成分多少等;甲苯胺藍(TB)染色觀察軟骨組織結構、軟骨細胞數量，TB著色情況和潮線的完整性。使用 Mankin′s評分[4]評估軟骨損傷情況，分數越高說明軟骨損傷越重。③關節液中 NO表達檢測:將關節腔灌洗液稀釋后，采用硝酸還原酶法測定 NO含量。

1.4 統計學方法 采用 SPSS18.0統計軟件。所有計量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，組內比較采用配對樣本 t檢驗。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 膝關節活動度 各組右膝關節活動度比較見表1。

表1 各組膝關節活動度比較(n=8，°，±s)

表1 各組膝關節活動度比較(n=8，°，±s)

注:與造模前比較，*P＜0.01;與造模成功時比較，△P＜0.05

組別 造模前 造模成功時 處死前即刻A組 162.1±4.9 106.1±3.3* 104.5±2.6 B組 162.5±3.9 106.0±2.6* 148.9±4.2△C組 161.5±3.3 102.9±3.1* 135.4±2.1△D組 160.8±5.1 104.9±2.6* 129.3±3.4△

2.2 膝關節軟骨病理改變 肉眼觀察:左膝關節軟骨表面光滑，淡藍色半透明狀，軟骨邊緣無骨贅形成。右膝空氣組軟骨表面粗糙，表面橫縱裂隙不規則，關節面糜爛潰瘍，內髁軟骨邊緣有少量骨贅形成，低劑量組軟骨表面較光滑，顏色較暗，可見關節面糜爛，較少見潰瘍，中、高劑量組軟骨表面粗糙呈顆粒狀，裂紋及糜爛較低劑量組多見。光鏡下觀察:空氣組軟骨表面粗糙不規則，裂隙較多，軟骨纖維細胞增多，軟骨細胞數量明顯減少，排列紊亂，臭氧低劑量組軟骨表面較規則，裂隙及纖維細胞較空氣組減少，軟骨細胞數量減少，散在分布，排列尚整齊，TB染色輕度減退，中、高劑量組軟骨細胞明顯減少，排列紊亂，有簇樣增生，潮線不完整，TB染色中、重度減退。空氣組和臭氧低、中、高劑量組關節軟骨的Mankin評分分別為(7.6±0.5)、(4.9±0.6)、(5.5±0.5)、(6.9±0.8)分。與空氣組比較，臭氧低、中、高劑量組右膝關節軟骨 Mankin評分降低(P＜0.05)，其中低劑量組 Mankin評分降低程度最大。

2.3 關節液 NO含量 空氣組和臭氧低、中、高劑量組 NO含量分別為(139.0±10.4)、(96.8±9.8)、(109.5±13.1)、(116.5±16.1)μmol/L，均明顯高于左膝的(34.1±3.4)μmol/L(P均 ＜0.05);與空氣組比較，臭氧低、中、高劑量組膝關節液中 NO含量明顯降低(P＜0.05)，其中低劑量組降低程度最大。

3 討論

近年來的研究顯示，NO在 OA的病理發展過程中發揮重要的生物學作用。關節內 NO是由一氧化氮合酶(NOS)催化生成。NOS有兩種亞型，包括結構型一氧化氮合成酶(cNOS)和誘導型一氧化氮合成酶(iNOS)。iNOS介導產生的 NO對組織有損傷作用，其通過間接表達促炎癥因子使 OA病變持續，抑制膠原蛋白和蛋白聚糖合成及誘導細胞凋亡。而cNOS介導產生的 NO對組織有疼痛緩解作用，且能減少 iNOS和 OA病理過程中產生 NO的有害作用。NO作用是雙重而復雜的[5，6]。OA時膝關節的正常力學軸線被破壞，關節最大壓力承受面由外側脛骨平臺轉至內側脛骨平臺與股骨內側髁，加之切斷交叉韌帶引起的關節不穩定，局部關節軟骨所承受的壓力相對增加，從而使軟骨發生變性。

關節軟骨分泌的 NO在 OA發生時生成增加，過量的 NO可抑制基質合成，促進基質降解;由于與超氧化物陰離子等氧化劑的反應，NO促使細胞損傷，使軟骨細胞對細胞因子誘導的凋亡更敏感[7]。在體外實驗中，人滑膜纖維母細胞在體外培養時無NO產生，當加入 IL-1β、TNF-α等后可活化其中的iNOS，產生大量 NO。IL-1β通過 NO促使人軟骨細胞基質金屬蛋白酶的合成，而 NOS抑制劑可抑制IL-1β誘導的基質金屬蛋白酶的表達。

臭氧治療 OA的機理可能為臭氧通過刺激氧化酶過度表達，抗炎和抑制免疫性反應，擴張血管、改善回流，促進炎癥因子和 NO的吸收;還可直接作用于神經末梢，刺激抑制性中間神經元釋放腦啡肽等物質，達到鎮痛效果。目前臭氧治療 OA的最佳濃度尚無定論。本研究結果顯示，25μg/ml醫用臭氧能改善 OA模型兔膝關節的活動度，降低關節液內NO濃度，對減輕 OA的關節軟骨損傷也有一定作用，提示 25μg/ml醫用臭氧可改善 OA模型兔膝關節內環境和關節運動功能。而 40、80μg/ml臭氧注入關節腔后僅膝關節活動度明顯改善，但其病理學檢查與 25μg/ml者比較并無明顯改善，可能是由于臭氧強大的氧化作用，使關節軟骨中的蛋白多糖和Ⅱ型膠原氧化，影響軟骨細胞和基質的增殖能力。而臭氧對兔膝關節炎關節軟骨的遠期作用及臨床療效的評價，還需要進行更加深入的研究。

本研究發現，三種濃度的臭氧均能減輕 OA的炎癥反應;但 40、80μg/ml濃度時可能導致關節軟骨組織結構破壞，應引起臨床重視。

[1]肖曉山.膝關節骨性關節炎的治療進展[J].中國臨床康復，2003，7(29):3996-3997.

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[5]Hancock CM，Riegger-Krugh C.Modulation of pain in osteoarthritis:the role of nitric oxide[J].Clin J Pain，2008，24(4):353-365.

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