輻射誘導 Egr-1調控腺病毒介導Trail基因體外表達及意義

劉桂紅，章龍珍 ，劉美艷 ，趙 麗

(1徐州醫學院附屬醫院，江蘇徐州 221006;2徐州醫學院腫瘤放射治療教研室;3徐州醫學院第三附屬醫院;4連云港市第四人民醫院)

選擇有效的目的基因是腫瘤基因治療的關鍵。腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(TNF-TRAIL)是TNF家族近年來新發現的凋亡分子之一，能誘導多種腫瘤細胞凋亡，且其凋亡通路不依賴 p53基因是否突變，對放化療抗拒腫瘤細胞仍然具有殺傷作用，成為目前研究熱點。如何調控轉移基因的體內表達被認為是基因治療的關鍵技術之一。目前在腫瘤基因治療中往往采用啟動子調控體內轉移基因的表達，Egr-1基因啟動子序列中的放射敏感性 CArG盒可感受體內外理化刺激，誘導 Egr-1基因表達，從而對與之相連的外源基因實現雙向性調控作用[1]。2010年，我們采用 Egr-1作為基因啟動子，經放射線誘導調控 Trail基因在 U251人膠質瘤細胞內表達，并觀察了 Trail基因表達量與放射劑量及放射時間的關系，旨在為膠質瘤細胞的基因治療奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 攜帶重組腺病毒(Ad-Egr-hTrail)的 293包裝細胞(上海交通大學醫學院生物化學實驗室葛勝芳博士惠贈，-70℃冰箱保存)，U251人膠質瘤細胞株 (中科院上海細胞生物研究所)。高糖DMEM培養基(GIBCO公司);小牛血清(Hyclone公司);胎牛血清(PAA公司);Trizol(Invitrogen公司);細胞總 RNA抽提試劑盒，cDNA第一鏈合成試劑盒，PCR反應試劑盒(Fermentas公司);Pronase(Roche公司);M-MLV逆轉錄酶(Promega公司);dNTPmixture(Invitrogen公司);T4DNA連接酶和無DNA酶的 RNA酶(NEB公司);瓊脂糖(Promega公司);100 bp Marker(天為時代公司);sybr green 1(ABgene公司);Trail引物序列(primer premier 5軟件設計、上海生物工程公司合成)。

1.2 實驗方法

1.2.1 Ad-Egr-hTrail載體構建擴增及鑒定 取攜帶 Ad-Egr-hTrail的 293包裝細胞 -70℃/37℃反復凍融 3次，以裂解細胞，釋放重組病毒。將上述細胞裂解液移至離心管中，12 000 r/min、離心 10 min。吸取含病毒的上清液感染 AE25crma細胞，大量擴增 Ad-Egr-hTrail行純化及測定滴度[1]。裂解腺病毒，提取重組病毒基因組 DNA[2]，以 Ad-Egr-hTrail DNA為模板，加入引物 P1和 P2于 PCR反應體系，進行 PCR反應。反應條件:95℃、5 min，94℃、1 min，60 ℃、1 min，72 ℃、90 s;72 ℃延伸 10 min，共30個循環。結果如期擴增出 1 037 bp的 hTrail片段，表明 hTrail全長已被成功插入到腺病毒基因中。

1.2.2 Ad-Egr-hTrail轉染 U251細胞 將 U251腦膠質瘤細胞按 1×105/孔接種于 6孔板，每組 3個復孔，培養至 70%～80%融合時，更換細胞培養液為血清培養液，將 Ad-Egr-hTrail以 MOI=100感染U251細胞;同時設空白對照組。

1.2.3 輻射誘導及 Trail mRNA表達檢測 ①照射時間效應觀察:U251細胞感染后 48 h予 X射線 2 Gy照射 。于照射前 (0 h)和照射后 2、4、8、12 h收獲細胞，提取總 RNA，用 M-MLV逆轉錄酶進行逆轉錄。②照射劑量效應觀察:U251細胞感染后 48 h，分別予 0、2、4、6、8、12、15 Gy X射線照射。照射后 4 h收獲細胞，提取總 RNA，用 M-MLV逆轉錄酶進行逆轉錄。取每組樣本的模板 cDNA反應液進行 PCR反應，每組 3個復管。加入靶基因 Trail引物 P3和P4或管家基因 GAPDH上下游引物于反應體系，每個樣品的GAPDH和Trail分管同板相同條件下于熒光定量 PCR儀上檢測 Trail相對表達水平(即實驗組目的基因表達相對于空白對照組的變化倍數)。

2 結果

2.1 U251細胞 Trail mRNA表達的照射時間效應照射后 1 h表達水平即開始增加，4～8 h維持在一較高表達水平，照射后 4 h表達水平最高，隨后開始下降。見圖1。

2.2 U251細胞 Trail mRNA表達的照射劑量效應隨放療劑量增加，Trail mRNA表達水平明顯增加，12 Gy時達到最高水平;隨放療劑量增加，表達水平開始下降。見圖2。

圖1 U 251細胞Trail mRNA表達的照射時間效應

圖2 U 251細胞Trail mRNA表達的照射劑量效應

3 討論

腦膠質瘤是最常見的原發性腦瘤，其治療以手術、放療、化療為主。由于大多數膠質瘤呈浸潤性生長，手術難以徹底切除，而且膠質瘤細胞對常規放療及化療誘導凋亡敏感性低，常規治療在殺死腫瘤細胞的同時，也會損傷正常的組織細胞，從而引起嚴重的毒副作用。

腫瘤基因—放射治療為解決這一難題開辟了新的治療途徑與方法，其原理是將輻射誘導性基因的調控序列與腫瘤殺傷基因相偶聯，轉染腫瘤細胞，在對腫瘤實施局部照射時誘導基因表達，通過射線與基因的雙重作用殺傷腫瘤，以達到降低照射劑量、減輕或緩解正常組織損傷和增強放射治療效果的目的。研究發現，Trail聯合輻射對腫瘤細胞有協同殺傷作用，增加膠質瘤細胞對放射線和化療藥物的敏感性[4，5]。已有研究表明，Egr-1基因啟動子可用于調控多種下游基因在腫瘤細胞內表達，且表達規律與目的基因及細胞株有一定相關性。但射線誘導Egr-1調控 Trail基因表達的文獻報道不多，將此方法用于治療腦膠質瘤尚未見報道。本研究選擇人源性的 Trail基因作為治療基因，利用 Egr-1啟動子的輻射誘導特性，構建輻射誘導表達腺病毒重組載體Ad-Egr-hTrail，體外將 Ad-Egr-hTrail轉染 U251人膠質瘤細胞株，從轉錄水平研究其輻射誘導表達規律。

本實驗結果顯示經 X射線后 Egr-1啟動子調控Trail基因的表達活性基本呈時間劑量依賴性，輻射劑量為 2 Gy時即能激活啟動子調控下游 Trail基因的表達，照射后 4 h其表達水平最高;隨著放療劑量增加，下游基因 Trail的表達量明顯增加，在 12 Gy時啟動子活性最強，隨著放療劑量增加，下游基因Trail的表達量有所下降，推測其原因可能為過高輻射劑量導致基因結構改變，使得 Egr-1啟動子活性下降，但具體機制尚需進一步研究。

總之，本研究證實 Egr-1啟動子誘導下游基因Trail的表達具有時間劑量依賴性，由于輻射束具有靶向性和可控性，借助日趨完善的三維立體照射技術，將射線束準確地照射腫瘤組織，并有效地控制腫瘤組織與正常組織的照射劑量，在降低正常組織損傷的同時，實現對目的基因腫瘤局限性表達的時空調控，本研究為腫瘤的綜合治療提供了新思路。

[1]杜平，戚中田，潘衛.分子病毒學原理與實驗技術[M].上海:第二軍醫大學出版社，2002:212-216.

[2]Zhang WW，Fang X，Branch CD，et al.Generation and identification of recombinant adenovirus by liposome2mediated transfection and PCRanalysis[J].Biotechniques，1993，15(5):868-872.

[3]徐梓榕，尹梅祥，梁顯球.磁共振臨床應用[M].廣州:廣東科學技術出版社，2002:24.

[4]Hori T，Kondo T，Kanamori M，et al.Ionizing radiation enhances tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand(TRAIL)-induced apoptosis through up-regulations of death receptor 4(DR4)and death receptor 5(DR5)in human osteosarcomacells[J].J Orthop Res，2010，28(6):739-745.

[5]Tsurushima H，Yuan X，Dillehay LE，et al.Radioresponsive tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand(TRAIL)gene therapy for malignant brain tumors[J].Cancer Gene Ther，2007，14(8):706-716.