蛋白激酶C活性對缺血再灌注心肌環氧化酶表達的影響

宋張娟，邱曉曉，王 青，汪 洋

(溫州醫學院，浙江溫州325035)

環氧化酶(COX)為體內花生四烯酸代謝過程中最主要的限速酶，文獻報道心肌缺血再灌注損傷時COX-2 mRNA表達增加［1］。蛋白激酶C(PKC)是一類依賴于二酰基甘油或磷脂酰絲氨酸及Ca2+刺激激活，能催化蛋白質內絲氨酸/蘇氨酸殘基磷酸化的蛋白激酶。近期實驗證明，心肌缺血再灌注時PKC活性顯著增強［2］。2008年6月，我們觀察了心肌缺血再灌注時PKC活性對COX-2表達的影響。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 SD大鼠40只，體質量150～250 g(雌雄不拘)，由溫州醫學院實驗動物中心提供;血清磷酸激酶(CK)，丙二醛(MDA);免疫組化試劑包括多聚賴氨酸、一抗(PKC、COX-2)、SP 試劑盒、DAB 顯色劑;PKC抑制劑多黏菌素B、PKC激動劑佛波酯(PMA)，使用前溶解于二甲基亞砜(1 μg/2ml)。

1.2 動物分組及處理 將40只大鼠隨機分為模型組、觀察1組、觀察2組及對照組各10只，前三組均參照文獻［3］采用冠狀動脈分支結扎術制備心肌缺血再灌注模型:腹腔注射5%水合氯醛(6～7mg/kg)麻醉，經氣管建立人工機械通氣，呼吸頻率65～70次/min，于胸骨左緣2～4肋間打開胸腔及心包膜，5-0號絲線縫扎冠狀動脈，結扎30min后使缺血心肌恢復血流灌注，再灌注1 h后結束實驗;其中觀察1組和觀察2組麻醉后分離左側股靜脈插管，并于冠狀動脈結扎術前20min分別經股靜脈注射PMA(1 nmol/kg)及多黏菌素B(2mg/kg)(參照文獻［4］折算劑量)。對照組為假手術組。

1.3 血清肌酸激酶(CK)和丙二醛(MDA)水平測定 實驗結束后各組均取靜脈血，離心后取血清，采用化學比色法測定CK和MDA水平，操作按試劑盒要求進行。

1.4 心肌組織PKC、COX-2測定 各組取血后均處死動物，沿心臟橫軸取2～3 mm心肌組織，生理鹽水沖洗干凈，吸干水分，10%甲醛固定，常規脫水、包埋、切片、入水，1%甲醇雙氧水室溫作用10min后沖洗;滴加抗原修復液，室溫10min;滴加正常山羊血清封閉液，室溫20min;滴加第一抗體，4℃過夜;滴加生物素化第二抗體(IgG)，37℃20min;滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液(S-A/HRP)，37℃20min;DAB顯色。結果判定標準:PKC表達以心肌細胞胞質呈棕黃著色為陽性染色，COX-2表達以每張切片心肌細胞質呈清晰黃褐色為陽性。觀察整個切片(100×)，中倍鏡下綜合染色強度和陽性細胞所占比例進行半定量測定。染色強度評分標準按不著色為0分、黃色為1分、棕黃色為2分、黃褐色為3分，陽性細胞所占比例評分標準按陽性細胞數＜10%為0分、10%～50% 為1分，50%～75% 為2分，≥75% 為3分。兩項評分相乘所得數值為免疫組化染色總評分。

1.5 統計學方法 采用SPSS11.5軟件進行統計學處理。計量數據以±s表示、組間比較采用成組t檢驗，PKC、COX-2表達比較采用獨立樣本間秩和檢驗。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 血清CK及MDA水平 實驗結束后四組血清CK及MDA水平見表1。

表1 四組血清CK及MDA水平比較(n=10，±s)

表1 四組血清CK及MDA水平比較(n=10，±s)

注:與對照組比較，*P＜0.05，△P＜0.01;與觀察1組比較，▲P＜0.05，#P＜0.01

組別 CK(U/ml) MDA(nmol/ml)模型組 71.39±23.37△# 17.39±3.05△#17.67±7.44 3.12±0.65觀察1組 29.06±20.52 6.34±1.28觀察2組 52.09±19.69＊▲ 15.24±2.11△#對照組

2.2 心肌組織PKC、COX-2表達 四組心肌組織PKC、COX-2表達情況見表2。

表2 四組心肌組織PKC、COX-2表達比較(分，±s)

表2 四組心肌組織PKC、COX-2表達比較(分，±s)

注:與對照組比較，*P＜0.01;與觀察1組比較，△P＜0.01

PKC COX-2模型組 10 2.13±0.63 4.24±1.26組別 n*觀察1組 10 5.67±1.51* 1.83±1.33觀察2組 10 2.33±0.82＊△ 5.33±1.03＊△對照組

3 討論

近年來，防治臟器缺血再灌注損傷發生已越來越受到關注。PKC是一組廣泛分布的具有單一肽鏈結構的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，參與多種生理功能。研究報道，心肌短暫缺血時細胞質膜上的磷酸肌醇水解產生二酰基甘油，可激活PKC使之從胞質轉位至胞膜，使胞膜上ATP依賴的K+通道(K+-ATP)開放，通道傳導性增加，K+外流、Ca2+內流減少，使動作電位時程縮短，從而減少ATP消耗、保護心肌細胞［5，6］。本研究顯示，模型組心肌 CK 及MDA水平明顯高于對照組，觀察1組顯著低于模型組，觀察2組顯著高于觀察1組。提示PKC激動劑PMA能減輕心肌缺血再灌注所致組織氧化損傷，而PKC抑制劑多黏菌素B則可阻斷此心肌保護作用。

COX又名前列腺素內過氧化物合成酶，為膜結合蛋白，有COX-1和COX-2兩種亞型。其中COX-2為誘生性酶，其表達受細胞內外各種刺激因素調節，與炎癥、疼痛等有密切關系，可通過催化花生四烯酸促進炎性前列腺素類物質合成，引起炎癥反應和介導炎性細胞毒性［7］。本實驗顯示，模型組心肌組織COX-2表達處于較高水平，觀察2組心肌組織PKC和COX-2均顯著低于觀察1組。提示COX-2在介導心肌損傷過程中有重要作用，PKC活性與COX-2表達具有相關性，但其具體調控機制尚未完全清楚。

綜上所述，PKC激活有利于減輕心肌氧化應激損傷，可能機制為下調COX-2表達;此為心肌缺血再灌注損傷的防治提供了依據。

［1］Domoki F，Veltkamp R，Thrikawala N，et al.Ischemia-reperfusion rapidly increase COX-2 expression in pig letcere bralarteries［J］.AM J physiol，1999，277(3pt2):H1207-H1214.

［2］Fliss H，Gattinger D.Apoptosis in ischemic and reperfusion rat myocardium［J］.Circ Res，1996，79(5):949-956.

［3］Anderson I，Adinolfi C，Doctrow S，et al.Oxidative signalling and inflammatory pathways in Alzheimer's disease［J］.Biochem Soc Symp，2001，(67):141-149.

［4］Baines CP，Wang L，Cohen MV，et al.Protein tyrosine kinase is downstream of protein kinase C for ischemic preconditioning's antiinfarct effect in the rabbit heart［J］.J Mol Cell Cardiol，1998，30(2):383-392.

［5］Wang WZ，Stepheson LL，Anderson GL，et al.Role of PKC in the late phase of microvascular protection induced by preconditioning［J］.J Surg Res，2002，106(1):166-172.

［6］何斌，王志農，王軍，等.蛋白激酶C在心肌缺血預處理中的作用機制研究［J］.中國體外循環雜志，2006，4(2):107-111.

［7］李艾寧，張杰，王建春.COX-2基因765G ＞C多態性與阿司匹林抵抗的關系［J］.山東醫藥，2010，50(7):80-81.