HCV NS5A結合蛋白順烏頭酸酶1的驗證研究

王曉杰，相久全，韓樂強，張錦前*，成 軍

(1首都醫科大學附屬北京地壇醫院，北京100015;2密云縣第二醫院;3大連市第六人民醫院)

HCV與肝臟脂肪變性、糖代謝異常、2型糖尿病等代謝類疾病密切相關［1］，肝臟脂肪變性與慢性丙型肝炎(CHC)疾病進展也有關［2，3］。近年研究發現HCV NS5A可能是肝臟脂肪變性及HCC發生發展的間接機制［4］。2009年9月～2010年9月，我們應用酵母雙雜交技術篩選肝臟cDNA文庫中HCV NS5A的結合蛋白，并對這些蛋白的相互作用進行實驗驗證，為HCV影響糖、脂類代謝的分子生物學機制研究提供實驗室依據和方向。

1 材料與方法

1.1 材料 肝癌細胞系 HepG2、pGBKT7-HCV NS5A、pcDNA3.1(-)-HCV NS5A、pcDNA3.1(-)-myc-his、pBIND-HCV NS5A、載 體 由 本室 保 存。DMEM細胞培養基購自美國GIBCO公司;酵母雙雜交所需各種培養基均購自美國Clontech公司;anti-HCV NS5A及anti-his單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司;細胞轉染試劑LipofectamineTM2000、哺乳動物雙雜交試劑盒(包括實驗所需質粒)、Dual-Luciferase?雙螢光素酶報告基因檢測系統購自美國Promega公司，逆轉錄試劑盒購自大連寶生物工程有限公司，引物合成及DNA測序由北京奧科生物公司完成。

1.2 方法

1.2.1 pGBKT7-HCV NS5A轉化酵母菌株并進行鑒定 誘餌質粒pGBKT7-HCV NS5A由本所構建保存，將前述質粒用醋酸鋰法轉導入酵母菌株AH109，隨后鋪平板(SD/-Trp培養基)，隨機挑取直徑＞2 mm的菌落PCR鑒定。

1.2.2 酵母菌株Y187(肝細胞cDNA文庫質粒轉化)與酵母菌株AH109(pGBKT7-HCV NS5A質粒轉化)配合 前述鑒定正確的AH109酵母接種于一缺培養基中，30℃振搖至A600為0.8～1.0后重懸于50 ml 2×YPDA培養基中，與4 ml含肝細胞cDNA文庫的酵母細胞于搖床中30℃輕微振搖培養配合48 h。顯微鏡下觀察到三葉草二倍體細胞后，離心將其酵母菌重懸于0.25×YPDA培養基，鋪三缺及四缺培養板各50塊，于孵箱中以30℃培養16 d后，再把直徑＞2 mm的菌落于鋪有X-α-gal的四缺培養基上劃線，生長且呈藍色的為二者蛋白結合的所篩選陽性的克隆。

1.2.3 陽性質粒的分析 在四缺培養基上挑取前述陽性克隆，于搖床中30℃劇烈振搖培養5 d后離心，提取酵母菌的質粒，電穿孔法轉化感受態菌，隨后于含氨芐LB平板上培養。再提取前述菌落質粒，進行酶切鑒定，認定正確后測序。測序結果與PUMED中的已知基因序列比對分析。

1.2.4 構建真核表達質粒pcDNA-3.1(-)-mychis-aconitase1 根據人順烏頭酸酶1(aconitase1)基因序列(Gene Bank accession:NM_002197.2)，在編碼區上游和下游設計合成一對引物(兩端分別引入XhoⅠ和HindⅢ限制性內切酶酶切位點):(上游:5'-CTCGAGATGAGCAACCCATTCGCAC-3';下游:5'-AAGCTTCTTGGCCATCTTGCGGATC-3')。TRIzol法提取HepG2細胞總RNA，逆轉錄制備成cDNA模板，隨后用前述引物進行PCR擴增，最終獲得aconitase1基因的全長序列。經電泳鑒定后回收純化，產物與pGEM-T載體連接，再轉化感受態細胞，鋪LB培養板37℃過夜。第2天挑取平板上單克隆菌再培養過夜后，提取質粒行XhoⅠ/HindⅢ雙酶切鑒定，酶切鑒定正確后測序。測序結果正確者再純化回收，與 XhoⅠ/HindⅢ雙酶切 pcDNA3.1-myc-his空載體連接，再行轉化鋪于LB/Amp固體平板，37℃過夜孵育后，提取質粒DNA后以XhoⅠ/HindⅢ雙酶切鑒定。

1.2.5 細胞培養、細胞轉染 以10%胎牛血清的DMEM培養液，37℃、5%CO2條件培養HepG2細胞，每3 d傳代一次。轉染前2 d，以1×106細胞/孔密度接種培養板。轉染質粒設為實驗組和陰性對照組，每孔轉染8 μg質粒DNA。

1.2.6 免疫共沉淀(CO-IP) 各組質粒轉染48 h后，提取各孔細胞的總蛋白，行CO-IP:細胞用PBS洗2次;各孔中加入冰預冷的非變性細胞裂解液(1%PMSF)完全裂解細胞;抽提細胞蛋白，收集上清;前述上清中加入Protein-G/A Beads，4℃搖床緩慢振搖4 h后離心收集上清;上清中再加入anti-his單抗后4℃緩慢振搖過夜;隨后EP管中再加入適量Protein-G/A Beads，此后再慢搖12 h;離心后棄上清;沉淀中加入5×SDS Buffer，煮沸15min;離心后收集上清。

1.2.7 SDS-PAGE及Western blot驗證CO-IP蛋白蛋白樣SDS-PAGE膠電泳后，轉膜，質粒pcDNA 3.1(-)HCV NS5A單轉染組、實驗組及陰性對照組各組使用同種單抗，即anti-HCV NS5A的單克隆抗體(1∶1 000稀釋)，4℃過夜封閉。二抗使用HRP-IgG(1∶1 000稀釋)，搖床上室溫搖1 h后，洗膜，壓片后再顯影及定影。

1.2.8 哺乳動物雙雜交(Mammalian Two-Hybrid)試驗 HepG2細胞培養后接種于12孔板后再培養48 h。每孔2 μg質粒轉染，共分如下各組:空細胞組;陰性對照組1(質粒 pACT、pBIND、pG5Luc共轉染);陰性對照組2(質粒 pACT-aconitase1、pBIND、pG5Luc共轉染);陰性對照組3(質粒pACT、pBINDHCV NS5A、pG5Luc共轉染);陽性對照(pG5Luc、pACT-myoD、pBIND-Id共轉染);實驗組(質粒pACT-aconitase1、pBIND-HCV NS5A、pG5Luc 共轉染)。轉染48 h后裂解細胞，雙熒光素酶活性檢測，數據取兩種酶檢測值的比值(即Firefly Luciferase和Renilla Luciferase兩種熒光值)。

1.2.9 統計學方法 使用SPSS11.0統計軟件，全部數據以±s表示，比較多個樣本均數采用方差分析，多個樣本均數兩兩比較用SNK-q檢驗，以P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 人肝臟cDNA文庫中HCV NS5A結合蛋白的酵母雙雜交篩選 人肝臟cDNA文庫蛋白與HCV NS5A蛋白結合使相應酵母配合，此時可在顯微鏡下觀察到三葉草狀二倍體細胞(圖1)。三缺和四缺培養基上生長出多個克隆，在鋪有X-α-gal的四缺培養基上長出8個陽性克隆。篩選出的肝細胞cDNA文庫質粒進行測序與同源性分析(根據PUMED數據庫)，發現其中兩個克隆為aconitase1。

2.2 Western blot結果 成功表達HCV NS5A(圖2)及aconitase1蛋白(圖3)(實驗重復3次，結果均一致)，并證實HCV NS5A與aconitase1蛋白在肝細胞HepG2內存在相互作用(圖4)(實驗重復3次，結果均一致)。

2.3 Mammalian Two-Hybrid實驗結果 將各組質粒分別轉染細胞后48 h，檢測相對熒光素酶活性值。實驗組的相對熒光素酶活性值(0.012 8±0.001 2)高于陰性對照組1(0.003 3±0.000 5)、陰性對照組2(0.004 2±0.000 8)、陰性對照組3(0.004 7±0.001 2)，P均 ＜0.05。因此，本實驗證實 HCV NS5A與人aconitase1蛋白在肝細胞HepG2內存在相互作用關系。

3 討論

有關慢性HCV感染多年的臨床流行病學及實驗研究資料表明，CHC常伴有糖尿病、脂肪肝等代謝性疾病;CHC與這些代謝性疾病的發生密切相關［5］，肝臟脂肪變性及胰島素抵抗(IR)可能是HCV引發代謝綜合征的中心環節，其分子生物機制是病毒導致的脂代謝紊亂。糖、脂代謝異常則加重IR，三者之間關系密切、互為因果、也可能相互促進，其中 IR 可能是中心環節［6，7］。

aconitase為三羧酸循環中的酶，催化檸檬酸轉變為異檸檬酸。檸檬酸本身不易氧化，在aconitase作用下，通過脫水與加水反應，使羥基由β碳原子轉移到α碳原子上，生成易于脫氫氧化的異檸檬酸，為進一步的氧化脫羧反應作準備。aconitase是為細胞提供能量的關鍵酶，在細胞代謝方面也起關鍵作用。

本研究我們通過酵母雙雜交篩選出HCV NS5A在肝細胞內與之可能存在相互作用的蛋白基因，并進一步通過體外細胞實驗(Mammalian Two-Hybrid及CO-IP實驗)證實了HCV NS5A與aconitase蛋白存在相互作用關系，為HCV感染合并2型糖尿病、脂肪肝等代謝性疾病的分子生物學機制的研究提供了一定的線索和研究思路。但HCV NS5A與aconitase蛋白的結合位點、結合方式，對aconitase功能以及進一步影響細胞代謝過程等一系列分子生物學機制尚未完全清楚，有待更為深入的研究。

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