大腸癌組織中TMS1基因甲基化狀態及其意義

周炳喜，韓雙印，張延瑞，楊玉秀

(河南省人民醫院，鄭州450003)

正確維持甲基化狀態是生長發育過程中所必需的，腫瘤的發生與甲基化狀態發生異常相關，表現為全基因組廣泛低甲基化和某些抑癌基因啟動子CpG島的高甲基化［1］。TMS1基因為抑癌基因，其甲基化使TMS1基因表達沉默。本研究采用甲基化特異性聚合酶鏈反應(MS-PCR)技術檢測38例大腸癌組織TMS1基因啟動子甲基化狀態并與正常結腸組織相對比，以探討TMS1甲基化與大腸癌發生的關系。

1 材料與方法

1.1 材料 選擇我院2008年11月～2009年4月手術切除的38例大腸癌及其距腫瘤邊緣3cm的正常結腸組織的石蠟冰凍標本。38例中男23例、女15例，年齡28～88歲、平均53歲。大腸癌組中直腸癌21例、結腸癌17例;病理結果:管狀腺癌8例、乳頭狀腺癌2例、管狀乳頭狀腺癌6例、黏液腺癌4例、管狀黏液腺癌3例、乳頭狀黏液腺癌1例、印戒細胞癌1例、低分化腺癌6例、中分化腺癌6例、高分化腺癌1例。根據UICC標準TNM分期，Ⅰ期6例、Ⅱ期18例、Ⅲ期14例。正常結腸組織病理未發現腫瘤細胞，所有患者均未接受過放化療。所有標本在DNA提取前置于-80℃低溫冰箱保存。

1.2 實驗方法

1.2.1 DNA提取 以傳統的酚—氯仿法從組織中提取DNA。

1.2.2 DNA的亞硫酸氫鈉修飾 取含1 μg DNA溶液 50 μl，加 2 mol/L NaOH 5.5 μl，37 ℃ 水浴 15min使DNA變性，加新鮮配制10 mmol/L氫醌30 μl及3 mol/L的亞硫酸氫鈉520 μl(pH 5.0)，混勻后加少許石蠟油避光50℃水浴16 h。

1.2.3 DNA純化 Wizard DNA純化試劑盒(Promega公司)純化，回收后的DNA溶于50 μl雙蒸水中，離心1min，加入終濃度為3 mol/L的NaOH 5.5 μl，室溫放置 5min 終止反應，加入 1 μl糖原、17 μl 17.5 mol/L醋酸銨、3倍體積的無水乙醇，-80℃放置2 h，離心去上清，70%乙醇500 μl洗滌，離心后去上清，加20 μl雙蒸水溶解。

1.2.4 MS-PCR Q 液 5.0 μl，10 mmol/L 的 dNTPs 0.5 μl，Bufer 2.5 μl，20 μmol/L 的引物各 0.5 μl，修飾后的 DNA 4.0 μl，Hotstar Tap 酶0.2 μl。TMS1 基因非甲基化引物:正鏈:5'-GGAGGTGGGGAGTTTAGGTTTTGTTTT-3'，反 鏈:5'-AATTCTCCAACACATCCAAAATAACATCA-3'，擴增長度為 272 bp。TMS1基因甲基化特異性引物:正鏈:5'-GCGGGGAGTTTAGGTTTCGTTTC-3'，反 鏈:5'-CCAACGCATCCAAAATAACGTCG-3'，擴增長度為207 bp。PCR 程序:96 ℃ 3min，96 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃30 s，共25個循環，最后延伸72℃ 4min，退火溫度64℃，以正常人外周血淋巴細胞DNA做陰性對照，水做空白對照，2%的瓊脂糖凝膠行電泳分析。

1.3 統計學方法 采用SPSS17.0統計分析軟件，計數資料的比較采用χ2檢驗，以P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大腸癌組織及正常結腸組織中TMS1基因表達分析 用TMS1-U引物可擴增出非甲基化條帶，用TMS1-M引物擴增出PCR產物表明CpG甲基化，電泳分析圖見圖1，結果示結腸癌組織甲基化條帶為陽性，正常結腸組織N1～N7中甲基化條帶均為陰性。

圖1 TMS1基因甲基化表達陽性條帶(M)

2.2 大腸癌組織及正常結腸組織中TMS1基因甲基化情況 38例大腸癌組織、正常結腸組織中TMS1基因甲基化陽性檢出率分別為24%(9/38)、0，P ＜0.05。

2.3 TMS1基因甲基化與大腸癌臨床病理特征的關系 見表1。

表1 TMS1基因甲基化與大腸癌臨床病理特征的關系

3 討論

DNA甲基化是DNA的一種天然修飾方式，甲基化的胞嘧啶多位于CpG島上，在DNA雙鏈中呈對稱分布。人類大約50%～70%的CpG島都處于甲基化狀態［2］。正常細胞中，基因啟動子區域的CpG島甲基化沉默基因逆轉錄是一種調節基因表達的手段。基因調控區保持甲基化狀態，則組織不會表達該基因，如果該基因組的調控區脫甲基化，則該基因表達。現在很多研究表明，DNA甲基化與腫瘤的發生有密切的關系。DNA甲基化可以在轉錄水平抑制基因的表達［3］，通過影響癌基因和抑癌基因的表達及基因組的穩定性參與腫瘤的發展。腫瘤細胞的基因組甲基化水平比正常組織低，但是伴有某些特定CpG島甲基化程度的增高。抑癌基因的高度廣泛甲基化使DNA發生轉錄抑制，抑癌基因的不能表達參與了腫瘤的發生。

TMS1基因是一個促凋亡基因［4］，它通過3種途徑實現促凋亡作用［5］，TMS1基因甲基化后發生基因沉默，從而減弱細胞凋亡，導致腫瘤發生。大腸癌是常見的消化道腫瘤，占惡性腫瘤的第3位，且發病率呈上升趨勢。隨著分子生物學技術的發展，人們利用相關基因的變化作為腫瘤的預防、診斷、治療和預后指標。本研究38例大腸癌患者TMS1基因甲基化的檢出率為24%，而正常結直腸組織中無甲基化表達，表明TMS1甲基化可能與大腸癌的發生有關。

研究證明，選擇性基因調控區胞嘧啶堿基的甲基化紊亂是腫瘤發生中常見的現象，與突變或缺失等基因結構性變異不同，DNA甲基化是一種表觀遺傳修飾，不改變DNA的一級結構，因此是可逆性的改變，通過逆轉啟動子甲基化，可使沉默的基因重新表達，從而為腫瘤的治療提供了新的途徑［6］。DNA甲基化依賴于DNA甲基轉移酶(DNMT)活性，它將甲基轉移至胞嘧啶的含氮雜環上。DNMT活性增加也是使DNA發生異常甲基化的原因之一，特異性的抑制DNMT的活性，如胞苷類似物、小分子抑制物、反義寡核苷酸、競爭性底物等，可使因高甲基化轉錄失活的抑癌基因恢復功能。體外常用的胞苷類似物有5-氮胞苷和5-氮脫氧核苷，利用其能誘導抑癌基因的表達及低甲基化的細胞毒性抗腫瘤。除胞苷類似物外，其他的藥物大多數處于臨床試驗階段。但是這些藥物無基因特異性，不能選擇性的活化沉默基因，同時大劑量應用時會對正常細胞有毒副作用，有待我們進一步研究藥物的特異性及基因甲基化位點。在基因水平上研究甲基化模式并用于指導腫瘤的臨床診斷治療，為腫瘤靶向治療提供了新方向。

［1］Feinberg AP，Tycko B.The history of cancer epigenetics［J］.Nat Rev Cancer，2004，4(2):143-153.

［2］Ehrlich M，Gama-Sosa MA，Huang LH，et al.Amount and distribution of 5-methylcytosine in human DNA from different types of tissues of cells［J］.Nucleic Acids Res，1982，10(8):2709-2721.

［3］Iguchi-Ariga SM，Schaffner W.CpG methylation of the cAMP-responsive enhancer/promoter sequence TGACGTCA abolishes specific factor binding as well as transcriptional activation［J］.Genes Dev，1989，3(5):612-619.

［4］Stone AR，Bobo W，Brat DJ，et al.Aberrant methylation and downregulation of TMS1/ASC in human glioblastoma［J］.Am J Pathol，2004，165(4):1151-1161.

［5］McConnell BB，Vertino PM.TMS1/ASC:the cancer connection［J］.Apoptosis，2004，9(1):5-18.

［6］Yoo CB，Jones PA.Epigenetic therapy of cancer:past，present and future［J］.Nat Rev Drug Discov，2006，5(1):37-50.