Bmi-1 mRNA在甲狀腺乳頭狀癌中的表達及其生物學意義

馮 云，盧秀波，詹菊輝，李軍紅，周會行，李振宇，程維剛，靳夢林，賀 亮，邱正倫

(1洛陽市中心醫院，河南洛陽471000;2鄭州大學第一附屬醫院)

研究表明Bmi-1作為一種廣泛表達核蛋白在鼻咽癌發生發展中起重要作用，同時是預測預后的一個分子指標［1］。文獻報道Bmi-1在多種腫瘤中高表達［2～4］，被認為是一種癌基因。然而，關于 Bmi-1 與甲狀腺乳頭狀癌的關系目前國內外尚未見報道。本研究采用RT-PCR技術檢測Bmi-1在甲狀腺乳頭狀癌中的表達，并研究其與甲狀腺乳頭狀癌臨床病理特征關系，加深對甲狀腺乳頭狀癌發生分子機制的理解。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2008年1月～2010年7月在洛陽市中心醫院和鄭州大學第一附屬醫院甲狀腺乳腺外科住院治療的甲狀腺乳頭狀癌患者51例，男17例、女34例，年齡28～72歲、平均53歲。根據AJCC癌癥分期手冊中的標準進行TNM分期，Ⅰ～Ⅱ期33例，Ⅲ～Ⅳ期18例。微小癌10例，濾泡乳頭型11例，高細胞型11例，嗜酸細胞型1例，彌漫硬化型9例，包裹型9例。發生淋巴結轉移19例。選取同期住院手術證實為甲狀腺腫標本及瘤旁正常組織22例作為對照組，年齡36～57歲、平均48歲。所有病例術前均未接受放療、化療及激素治療，病歷資料完整。

1.2 檢測方法

1.2.1 標本收集與處理 標本一次取材約200mg，立即放入-80℃冰箱保存，其余組織送常規病理檢查確診。

1.2.2 主要試劑及儀器 總RNA分離試劑TRIzol試劑購自Gibco公司，RT-PCR試劑盒購自TaKaRa大連寶生物工程有限公司，Bmi-1、GAPDH引物均由北京賽百盛公司合成，低溫高速離心機購自德國Hettich公司，PCR擴增儀購自 BIO-RAD，UV-3200型紫外分光光度計為日本島津公司產品，IBAS2.5全自動圖像分析系統為德國Kontron公司產品。

1.2.3 組織RNA抽提 按照TRIzol試劑盒說明書抽提組織總RNA，DEPC水溶解，-80℃凍存。

1.2.4 cDNA合成 應用M-MLV逆轉錄酶，每份組織取3 μl總RNA進行逆轉錄，反應體系為20 μl。按照說明書加入各項試劑混勻后置37℃水浴1 h，95℃ 5min終止反應。終產物cDNA-20℃保存。

1.2.5 PCR反應 按試劑盒說明進行。反應體系:10 × Buffer 2.5 μl，dNTP 2.5 μl，TaqDNA 聚合酶0.5 μl，上、下游特異引物各1 μl，模板1.5 μl，DEPC處理ddH2O水補足25 μl，混勻，離心。Bmi-1引物序列為 5'-ATGCATCGAACAACGAGAACT-3'和 3'-TCAACCAGAAGAAGTTGC-5'，片段長度為 269 bp。反應條件:預變性94℃ 5min，變性94℃ 30 s，退火55℃ 30 s，延伸72℃ 45 s，進行30個循環，最后72℃延伸10min。β-actin引物序列:p3 5'-CCATGGAGAAGGCTGGGG-3'，p45'-CAAAGTTGTCATGGATGACC-3'，片段長度為 377 bp。

1.3 統計學方法 采用SPSS10.0軟件進行統計學處理，所得數據百分率比較采用 χ2檢驗。以P≤0.05為有統計學差異。

2 結果

2.1 Bmi-1 mRNA在不同甲狀腺組織中的表達見圖1。Bmi-1 mRNA在甲狀腺乳頭狀癌組、良性組和正常組中的表達量分別為6.237±0.535、2.112±0.107和 2.266±0.156，F=1221.61，P ＜0.01;甲狀腺乳頭狀癌組高于良性組(t=40.70，P＜0.01)和正常組(t=39.01，P ＜0.01)。

圖1 Bmi-1 mRNA在不同甲狀腺組織中的表達

2.2 Bmi-1 mRNA表達與甲狀腺乳頭狀癌臨床病理參數的關系 ①性別:Bmi-1 mRNA在男性患者和女性患者中陽性率分別為58.9%(10/17)和50.0%(17/34)，χ2=0.354，P=0.552。②年齡:Bmi-1 mRNA在＜45歲和≥45歲患者中陽性率分別為 42.9%(9/21)和 60.0%(18/30)，χ2=2.212，P=0.137。③病理類型:Bmi-1 mRNA在微小癌中陽性率為60.0%(6/10)，濾泡乳頭型癌為54.5%(6/11)，高細胞型癌為54.5%(6/11)，嗜酸細胞型癌為0，彌漫硬化型癌為44.4%(4/9)，包裹型癌為55.5%(5/9)，P=0.981。④分期:Bmi-1 mRNA 在Ⅰ～Ⅱ期和Ⅲ～Ⅳ期中陽性率分別為48.5%(16/33)和61.1%(11/18)，χ2=0.745，P=0.388。⑤淋巴結轉移:Bmi-1 mRNA在有無淋巴結轉移組陽性率分別為 78.9%(15/19)和37.5%(12/32)，χ2=8.220，P=0.004。

3 討論

Bmi-1基因屬于多梳基因家族成員(PcG)，為較早發現的哺乳類動物PcG成員，其家族成員包括Bmi-1、Mel-18、BLG 等一系列保守且重要的蛋白［5］，人類Bmi-1基因定位于10號染色體短臂13區，其cDNA長3 202 bp，ORF編碼一個含326個氨基酸的蛋白質，該蛋白質含有一個位于N末端的環指結構域(RF)和位于中心保守DNA結合模序螺旋—轉角—螺旋—轉角結構域，正是這兩個區域對細胞轉化和腫瘤形成具有重要作用［6］。在胚胎期Bmi-1對哺乳動物的骨骼、造血及神經發育發揮重要作用，而在腫瘤的發生發展中，高表達Bmi-1的腫瘤細胞被認為是腫瘤中存在的“癌癥干細胞”［7］。因此Bmi-1基因的發現為腫瘤的發病機制、臨床病理聯系及判斷預后提供了一個新思路。

本研究首次報道甲狀腺乳頭狀癌中Bmi-1 mRNA表達顯著高于良性及正常組織，提示甲狀腺乳頭狀癌組織中存在Bmi-1基因高表達現象。本研究還顯示，Bmi-1高表達與甲狀腺乳頭狀癌的淋巴結轉移密切相關，而與患者年齡和性別無關，提示Bmi-1高表達與甲狀腺乳頭狀癌的發生發展、浸潤轉移有關，有可能成為甲狀腺乳頭狀癌早診和預后判斷的候選標志物。

［1］Song LB，Zeng MS，Liao WT，et al.Bmi-1 is a novel molecular marker of nasopharyngeal carcinoma progression and immortalizes primary human nasopharyngeal epithelial cells ［J］.Cancer Res，2006，66(12):6225-6232.

［2］Vonlanthen S，Heighway J，Altermatt HJ，et al.The bmi-1 oncoprotein is differentially expressed in non-small cell lung cancer and correlates with INK4A-ARF locus expression ［J］.Br J Cancer，2001，84(10):1372-1376.

［3］Sawa M，Yamamoto K，Yokozawa T，et al.BMI-1 is highly expressed in M0-subtype acute myeloid leukemia［J］.Int J Hematol，2005，82(1):42-47.

［4］Zhang F，Sui L，Xin T.Correlations of BMI-1 expression and telomerase activity in ovarian cancer tissues［J］.Exp Oncol，2008，30(1):70-74.

［5］Haupt Y，Alexander WS，Barri G，et al.Novel zinc finger gene implicated as myc collaborator by retrovirally accelerated lymphomagenesis in E mu-myc transgenic mice［J］.Cell，1991，65(5):753-763.

［6］Li Z，Cao R，Wang M，et al.Structure of a Bmi-1-Ring1B polycomb group ubiquitin ligase complex［J］.J Biol Chem，2006，281(29):20643-20649.

［7］Raaphorst FM.Self-renewal of hematopoietic and leukemic stem cells:a central role for the Polycomb-group gene Bmi-1［J］.Trends Immunol，2003，24(10):522-524.