TLR2/TLR4基因多態性與慢性牙周炎的相關性研究*

于 慧 林 梅 林 婷 張 菁 王左敏

牙周炎是由牙菌斑中的微生物所引起的牙周支持組織的慢性感染性疾病，導致牙周袋形成、進行性附著喪失和牙槽骨的吸收，它是世界范圍內牙齒喪失的首要原因。Toll樣受體(Toll-like Receptors，TLRs)是近年來發現的重要免疫受體，它通過與配體結合，引起細胞活化，釋放炎癥因子，從而導致炎癥的發生、發展。病原體相關分子模式(pathogen associatedmolecularpatterns,PAMPs)是存在于低等微生物或其細胞壁上的一些保守成分，不同的PAMPs可以被不同的Toll樣受體所識別或組合識別[1]。TLR2和TLR4識別的PAMPs包括牙齦卟啉單胞菌、伴放線放線桿菌、福賽擬桿菌等革蘭陰性菌細胞壁外膜中的脂多糖(LPS)[2]，其在細菌死亡或菌體崩解時釋放出來，與牙槽骨的快速破壞密切相關，對牙周組織有很高的毒性和抗原性，是牙周炎癥的重要病因之一，在牙周炎的病理發展過程中起重要的調節作用。齦下菌斑雖然是導致牙周疾病的主要原因，但單一的微生物因素不足以引起病損，不同個體對細菌的炎癥反應和免疫應答不同，因此宿主的遺傳易感性在牙周炎的病理進程中也起著關鍵作用。我們推測Toll樣受體的基因多態性，可能調節宿主對慢性牙周炎反應強度，進而引起蛋白功能的表達和疾病炎癥的表現。本實驗通過病例對照研究，旨在探討TLR2/TLR4基因多態性與慢性牙周炎易感程度和疾病進展的嚴重程度，從而初步揭示牙周炎發病的分子遺傳機制。

1.材料與方法

1.1 研究對象 研究對象來自首都醫科大學附屬北京朝陽醫院口腔科，從2009年1月至2011年4月就診的患者。納入標準為：漢族；口腔內存留牙不少于15顆；受試前未接受牙周治療；婦女未妊娠和哺乳；無糖尿病、心血管疾病和內分泌等系統性慢性疾病；入選前4周無感冒、發燒及其它部位炎癥性病變；近半年內未使用抗生素、免疫抑制劑。按照第三次美國國家健康與營養調查中牙周健康的分類標準[3]，納入研究為臨床診斷為中重度的慢性牙周炎患者。(0度：牙周健康；輕度牙周炎：至少含有一顆牙齒PD≥3mm且AL≥3mm，同時PD≥4mm且AL≥3mm的牙齒≤30%；中度牙周炎：PD≥5mm且AL≥4mm的牙齒＜30%，或PD≥4mm且AL≥3mm的牙齒在30%-60%之間；重度牙周炎：PD≥5mm且AL≥4mm的牙齒≥30%，或PD≥4mm且AL≥3mm的牙齒≥60%)。選擇符合納入標準的患者，簽署知情同意書后納入本研究共781例，其中男538人、女243人，平均年齡分別為65.43歲及63.10歲。分為健康對照組143人，中度牙周炎196人，重度牙周炎442 人(表 1)。

1.2 牙周健康狀況檢查 檢查受試者所有存留牙齒，每顆牙查2個位點，分別記錄頰側近中值及舌側遠中值。牙周臨床指標包括：牙周探診深度(probing depth，PD)，牙周附著喪失(attachmentloss，AL)，齦溝出血指數(sulcubleeding index，SBI)，菌斑指數(plaque index，PLI)，松動度和骨吸收狀況。所有受試者的牙周狀況均由牙周專科醫生完成。

表1 基本情況

1.3 外周血收集和基因組DNA的提取 抽取受試者前臂靜脈血4ml，EDTA抗凝，于-20°C凍存。靜脈血樣本冰上解凍，紅細胞裂解液離心后取沉淀白細胞，加10%SDS、ES和蛋白酶混勻，37℃過夜。鹽析離心后取上清，氯仿離心抽提，無水乙醇析出DNA，70%乙醇洗滌DNA后，轉移到Ependoff管，晾干，加TE緩沖液200ul于-80℃凍存待PCR。

1.4 基因型測定 應用美國ABI公司7900HT聚合酶鏈反應儀，采用TaqMan MGB探針的實時定量PCR SNP分型方法[4]。該方法具有高通量的特點，適用于大規模SNP篩查。

反應體系：PCR總反應體積25ul，DNA模板0.5ul，2.5ul TaqMan universal PCR master mix 2×(Applied Biosystems，Fost er Ci t y，CA ，US A)，0.125ul 40×TaqMan genotyping assay mix ，超純水1.875 ul。反應條件：95℃預變性10min,95℃變性15s，60℃退火1min，共50個循環，然后使用SDS2.3分型軟件進行基因型區分。對部分樣本進行重復實驗，并設空白對照以確保分型的準確性，重復分型的樣品和原來分型結果完全一致。

1.5 統計學處理 采用SPSS16.0統計軟件包分析。研究各組基因型頻率、等位基因頻率、類型及分布特點。χ2檢驗用于比較組間基因型和等位基因的頻率分布。哈迪一溫伯格(Hardy—Weinberg)法則驗證兩組中的基因型分布是否平衡。比值比(odds ratio，OR)和95%可信區間(confidence interval，CI)檢驗基因型與牙周炎發病的相對風險。THESIAS軟件包分析兩組中基因單倍體型差異。P＜0.05作為統計學顯著性標準。

2.結果

2.1 Hardy—Weinberg遺傳平衡定律檢驗對TLR2/TLR4多態性位點基因型頻率進行H-W遺傳平衡定律檢驗，結果均P＞0.05。

2.2 TLR2/TLR49個位點基因型和等位基因頻率的分布 在對照組和中、重度牙周炎分組中，發現TLR2/TLR49個多態性位點基因型和等位基因的頻率沒有顯著性差異，均為P＞0.05(表2、3)，但TLR4+1667 rs11536889，在中、重度牙周炎患者中有統計學意義(P＜0.05)，GG基因型在中度和重度牙周炎組的分布頻率，較GC+CC基因型顯著增高，P＜0.05(表4)。

2.3 單倍型分析 TLR4 rs1927907、rs11536889、rs7873784等3個相鄰多態性位點構建6種單倍型，結果G-C-G(rs1927907-rs11536889-rs7873784)單倍型在中、重度牙周炎組分布有差異P＜0.05，相對危險值為1.449(表5)。

2.4 人群特征 對納入的所有受試者進行了吸煙史、每天吸煙包數、每天刷牙次數的比較，發現中、重度牙周炎組目前或曾經吸煙的比例更高，P=0.04(表6)，又對吸煙人群進行了分層，發現每天平均吸煙的包數對牙周炎沒有顯著性影響，P＞0.05(表7)。早晚兩次刷牙占受試者比例較多，但刷牙次數對牙周炎沒有顯著性影響P=0.707(表 8)。

3.討論

Toll樣受體是一種重要的模式識別受體，革蘭陰性細菌可以被TLR2、TLR4識別，產生以依賴于TLRs的模式識別病原微生物及其細胞壁具有的脂多糖特殊結構，來介導宿主相關細胞因子的分泌和天然免疫應答，使牙齦上皮細胞對炎性刺激做出反應，因此TLRs基因多態性可能改變受體的結構域，導致對致病菌的特異性識別，也可能是牙周病的遺傳危險因素。TLR4是革蘭陰性菌主要天然受體分子,TLR4在細胞外與LPS結合能誘發細胞產生過多的炎性因子如白細胞介素(IL-1、IL-6)、腫瘤壞死因子(TNF-α)等細胞因子，介導先天性免疫和炎癥反應，引發過強炎癥反應從而導致過重的牙周損傷和骨吸收。TLR4基因發生點突變或缺失，細胞介導LPS信號傳導功能亦隨之消失[5]。在敲除小鼠TLR4基因后，對LPS的刺激無應答[6]。國內外檢測慢性牙周炎患者牙齦組織中TLR2、TLR4 mRNA的表達情況，發現牙齦上皮細胞表面和細胞內表達量顯著高于健康對照組，隨后用TLRs配體或連同IL-17刺激牙齦上皮細胞后，檢測牙齦上皮細胞所釋放的炎性因子，均有IL-1和TNF-a的產生[7.8]。在歐洲人群中Schroder NW[9]等檢測197名德國慢性牙周炎患者的TLR2 Arg753Gln和TLR4 Asp299Gly、Thr399Ile，發現TLR4基因多態性是牙周炎發生發展的危險因素P＜0.0001。Ozturk A[10]對來自不同歐美國家的7篇論著，共計774例慢性牙周炎患者的TLR4 Asp299Gly和Thr399Ile的基因多態性結果，通過Meta-analysis的方法進行綜合分析，結果TLR4Thr399Ile有統計學意義P=0.006，成為牙周炎的危險因素之一。在亞洲人群中，日本研究TLR2、TLR49個多態性位點，結果病例組和對照組TLR4(rs11536889)有顯著差異P=0.043，并且發現這個位點的CC基因頻率在中、重度牙周炎患者中較高[11]。

表2 TLR2基因型和等位基因頻率

表3 TLR4基因型和等位基因頻率

表4 TLR4 rs11536889基因型和等位基因頻率

表5 TLR4(rs1927907-rs11536889-rs7873784)單倍型比值比和95%可信區間

表6 吸煙史

表7 吸煙人群每天吸煙包數

表8 每天刷牙次數

本研究發現TLR2/TLR49個位點基因型和等位基因頻率的分布，在健康對照組和中、重度牙周炎分組中，發現沒有顯著性差異，均為P＞0.05(表 2、3)。但TLR4+1667 rs11536889，在中、重度牙周炎患者中有統計學意義，P=0.049，GG基因型在中度和重度牙周炎組的分布頻率，較GC+CC基因型顯著增高，P=0.041，說明攜帶+1667GG基因型的患者更易發展成為重度牙周炎(表4)。在rs11536889、相鄰3個多態性位點構建6種單倍型，結果G-C-G(rs1927907-rs11536889-rs7873784)單倍型在中、重度牙周炎組分布有差異P＜0.05，相對危險值為1.449(表5)。提示TLR4的多態性與中等程度以上的慢性牙周炎有重要關系，其單核苷酸多態性會影響牙周疾病嚴重程度的進展，導致更嚴重的炎性應答損傷程度，致使過剩的細菌產物和炎性因子的產生，引起牙周組織更深程度的破壞，是牙周疾病的遺傳易感因素之一。TLR4(rs11536889)位于3’端非轉錄區，它對氨基酸的合成沒有影響，但是位于內顯子和非轉錄區的單核苷酸多態性對翻譯和轉錄有影響，對調節mRNA的合成有重要的意義。吸煙是牙周炎的危險因素，研究發現中、重度牙周炎組目前或曾經吸煙的比例更高，P=0.04(表6)，為了明確吸煙數量是否對牙周炎進展有影響，我們又對吸煙人群進行了分層，發現平均每天吸煙包數對牙周炎沒有顯著性影響，P＞0.05(表7)。刷牙是機械性控制菌斑最好的方法，研究發現每天早晚兩次刷牙占受試者比例較多，但刷牙次數對牙周炎沒有顯著性影響P=0.707(表 8)。

慢性牙周炎受多種因素影響，不同種族、不同地域的遺傳特征對牙周炎的易感性也有很大的差異。由于本研究的TLR2多態性的低檢出率，尚不能對其與牙周炎基因遺傳易感性做出相關結論，提示這種多態性在中國人群中非常稀少，該基因的分布規律與種族的差異有關，這與國外的研究結果相一致。在白種人群中TLR2Arg753Gly,TLR4 Asp299Gly和Thr399Ile基因多態性與慢性牙周炎的易感性沒有相關性[12]。NoackB[13]檢測德國中重度牙周炎患者TLR 2 Arg677Trp、Arg753Gln、TLR4Asp299Gly、 Thr399Ile、 rs4986790 和rs4986791，研究發現病例組和對照組的基因型和等位基因的頻率沒有統計學意義(P＞0.05)。

牙周炎的遺傳易感性也可能與Toll樣受體的其他多態性位點有關，但我們沒有對TLRs的SNPs逐一進行檢測；慢性牙周炎不是單基因疾病，其發病可能是多個基因相互關聯作用，并且與微生物、環境、精神壓力、等其他混雜因素協同作用影響，例如口腔衛生習慣、唾液、牙石的分布等；年齡也是牙周炎的危險因素之一，慢性牙周炎患者尤其以老年人居多，但老年人的基因突變率較低，對檢測結果可能會有影響。目前就TLRs基因多態性對牙周疾病易感性的影響程度需更深入研究，考慮種族及地域的差異會影響TLRs多態性的分布，需進一步研究TLRs對蛋白功能的影響。

[1]Aderem A,Ulevitch RJ.Toll-like receptors in the induction of the innate immune response[J].Nature 2000,406：782-787

[2]Yoshimura A,Kaneko T,Kato Y,Golenbock DT,Hara Y.Lipopolysaccharides from periodontopathic bacteria Porphyr omonas gingival and Capnocytophaga ochracea are antagon ists for human Toll-like receptor 4[J].Infect Immune 2002，70：218-225

[3]AlbandarJM， Brunelle JA， Kingman A.Destructive periodontal disease in adults 30 years of age and older in the United States， 1988-1994[J].J Periodontal 1999， 70(1)：13-29

[4]Lie YS， Petropoulos CJ.Advances in quantitative PCR technology：5’nuclease assays[J].Curr Opin Biotechnol，1998，9(1)：43-48

[5]Poltorak A,He X,Smirnova I,et al.Defective LPS signaling in C3H/HeJ and C57BL/10ScCr mice：Mutations in TLR4 gene[J].Science， 1998 ，282：5396(2085-2088)

[6]Hoshino K,Takeuchi O,Kawai T,et al.Toll-like receptor 4(TLR4)-deficient mice are hyporesponsive to lipopo lysaccharide：evidence for TLR4 as the LPS gene product[J].J of Immunology,1999，162(7)：3749-3752

[7]Y Sun,Q-M Guo,D-L Liu,M-Z Zhang,R Shu.In vivo expression of Toll-like receptor 2,Toll-like receptor4,CSF2 and LY64 in Chinese chronic periodontitis patients[J].Oral Diseases,2010，16(4)：343-350

[8]吳瑩瑩,劉洪臣.TNF-α、IL-1β及IL-6與糖尿病及牙周炎之間的關系[J].中華老年口腔醫學雜志2011,9(2)：117-121

[9]Schr?derNW,MeisterD,WolffV,etal.Chronic periodontal disease is associated with single-nucleotide polymorphisms ofthe humanTLR-4 gene[J].Genes Immune 2005， 6(5)：448-451

[10]Ozturk A,Vieira AR.TLR4 as risk factor for periodontal disease：areappraisal[J].J Clin Periodontal,2009,36：279-286

[11]Fukusaki T,Ohara N,Hara Y,Yoshimura A,Yoshiura K.Evidence for association between a Toll-like receptor 4 gene polymorphism and moderate/severe periodontitis in the Japanese population[J].J of Periodontal Res,2007,42：541-545

[12]Berdeli A,Emingil G,HanSayganB,etal.TLR2 Arg753Gly,TLR4 Asp299Gly and Thr399Ile gene polym orphisms are not associated with chronic periodontitis in a Turkish population[J].J Clin Periodontal,2007,34：551-557

[13]Noack B,Grgens H,Lorenz K,Schackert HK.et al.TLR4 and IL-18 gene variants in chronic periodontitis：Impact on disease susceptibility and severity [J].Immunological Investigations?2009,38(3-4)：297-310