喉鱗狀細胞癌中STK15蛋白和BUBR1蛋白的表達及相互作用

馬洪峰，郭星，李曉瑜

（中國醫科大學附屬第一醫院耳鼻咽喉科，沈陽 110001）

中心體異常及紡錘體檢控點缺陷導致的基因組不穩定被認為是腫瘤發生的重要因素。絲氨酸/蘇氨酸激酶 15（serine/threonine kinase-15，STK15）基因，又稱BTAK或aurora2基因，定位于20q13，基因已克隆，有9個外顯子，全長cDNA 1.8 kb，編碼一種（403個氨基酸，分子量46 kDa）中心體相關激酶，對染色體分離和中心體功能都至關重要；已證實STK15是一種癌基因，在多種腫瘤中都出現了擴增，其mRNA和蛋白過表達［1］。BUBR1基因定位于15q15區域，cDNA全長3 702 bp，含有23個外顯子和22個內含子，編碼BUBR1蛋白，分子量為120 kDa，由1 050個氨基酸組成；該蛋白是紡錘體檢控點處的一個重要功能蛋白，BUBR1的缺陷可引起染色體的不穩定［2］。已有文獻報道喉鱗狀細胞癌中存在STK15和BUBR1蛋白的異常表達，而關于兩者相互作用的研究尚未見報道。本研究通過免疫組織化學方法證實STK15和BUBR1蛋白的表達與喉鱗狀細胞癌具有相關性，并應用免疫熒光共定位實驗探討喉鱗狀細胞癌中STK15和BUBR1蛋白的相互作用。

1 材料與方法

1.1 標本的來源及制備

40例喉癌組織標本及癌旁正常組織標本均來源于中國醫科大學附屬第一醫院2006年9月至2009年6月間的住院患者。患者均經病理診斷為喉鱗狀細胞癌，均為首發病例，術前未經放療和化療。術后取一組標本固定于4%多聚甲醛中，送交喉癌研究室制成蠟塊。另一組標本立即儲存在-70℃冰箱中，待制備冰凍切片。所取標本均經患者及家屬知情同意。

1.2 試劑及方法

1.2.1 主要試劑：小鼠抗人BUBR1蛋白質抗體，山羊抗人STK15蛋白質抗體，驢抗鼠IgG-FITC（綠光），兔抗山羊IgG-TRITC（紅光），均購于Santa Cruz公司；SP免疫組織化學染色試劑盒（小鼠、山羊）、DAB顯色劑，購于福州邁新生物公司。

1.2.2 試驗方法：免疫組織化學SP法檢測STK15和BUBR1蛋白的表達水平：組織石蠟塊切片，厚度4μm，分別進行蘇木精—伊紅染色和SP免疫組織化學染色。實驗按SP免疫組織化學染色試劑盒的指導步驟進行，采用檸檬酸高壓煮沸2 min，進行抗原修復，STK15抗體工作濃度1∶500，BUBR1抗體工作濃度1∶80，以STK15和BUBR1均陽性表達的乳腺癌標本做陽性對照，PBS代替一抗做陰性對照。免疫熒光共定位試驗：取-70℃冰凍標本（免疫組織化學實驗中STK15和BUBR1均陽性表達的喉癌組織標本）制作冰凍切片，丙酮-20℃固定，一抗STK15（1∶500）、BUBR1（1∶100）混育，4 ℃過夜。二抗兔抗山羊 IgG-TRITC（1∶100）、驢抗鼠 IgG-FITC（1∶100）37 ℃混育40 min。熒光顯微鏡下觀察。

1.3 結果判定

1.3.1 免疫組織化學結果觀察及判定：與陰性對照相比，STK15和BUBR1蛋白陽性表達為棕黃色或棕褐色細顆粒，主要定位于細胞質，細胞核少量表達。光學顯微鏡下進行圖像采集，所得圖像經光密度圖像分析儀分析平均光密度，平均光密度值用來量化蛋白表達的強度，平均光密度值越大蛋白表達越強。

1.3.2 免疫熒光共定位結果觀察及判定：選擇免疫組化實驗中STK15和BUBR1蛋白表達均陽性的喉癌組織標本進行冰凍切片免疫熒光共定位實驗。熒光染色切片在熒光顯微鏡下觀察，熒光染色主要定位于細胞質，細胞核少量。STK15蛋白標記為紅色熒光，BUBR1蛋白標記為綠色熒光。若2種標記重疊為黃色熒光，可認為2種蛋白共定位，提示可能存在相互作用。

1.4 統計學處理

數據采用x±s表示。應用SPSS13.0統計軟件，兩樣本均數比較進行t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 喉癌組織和癌旁正常組織中STK15和BUBR1蛋白的表達水平

圖1 喉癌和癌旁組織中STK15蛋白和BUBR1蛋白的陽性表達×400Fig.1 Positive expression of STK15 and BUBR1 in LSCCtissue and paired normal tissue×400

免疫組化結果表明，喉癌組織和癌旁正常組織中STK15和BUBR1蛋白均可見陽性表達（圖1）。喉癌組織和癌旁正常組織中STK15蛋白平均光密度值分別為（159.2±3.96）×10-3和（156.5±2.24）×10-3（t=3.722，P<0.05），BUBR1蛋白平均光密度值分別為（117.1±1.95）×10-3和（118.6±1.71）×10-3（t=3.464，P<0.05），喉癌組織中STK15蛋白表達水平高于癌旁正常組織，BUBR1蛋白表達水平低于癌旁正常組織。

2.2 免疫熒光共定位結果

喉癌組織中STK15蛋白和BUBR1蛋白均在細胞質及細胞核中表達。熒光顯微鏡觀察，紅色熒光為STK15蛋白表達標記，細胞質中熒光亮度較強，細胞核次之（圖2A）；綠色熒光為BUBR1蛋白表達標記，仍為細胞質中熒光亮度較強，細胞核次之（圖2B）。熒光照相系統整合重疊后的圖像中，胞質和胞核內紅、綠2種熒光標記重疊為黃色熒光（圖2C），可認為STK15和BUBR1蛋白在喉鱗狀細胞癌中的細胞質及細胞核中共定位，提示兩者可能存在相互作用。

圖2 喉癌組織中STK15蛋白和BUBR1蛋白的免疫熒光共定位×400Fig.2 Immunofluorescence of STK15 and BUBR1 protein in LSCCtissue×400

3 討論

STK15和BUBR1都在細胞有絲分裂過程中扮演重要角色。STK15是一類廣泛存在于真核細胞中的絲氨酸/蘇氨酸激酶，參與細胞DNA合成后期/有絲分裂期（G2/M）轉換，通過促進中心體成熟及微管晶核形成確保雙極紡錘體的形成，從而保持基因組穩定［1］。BUBR1是存在于哺乳動物中的有絲分裂檢控點基因家族MAD3的同源基因，BUBR1可以通過自身或作為有絲分裂檢查點復合物的成分抑制泛素聯接酶—后期促進復合體的活性，激活有絲分裂檢控點信號級聯放大。近年來的研究表明，在多種惡性腫瘤中存在著STK15基因擴增、過表達及BUBR1 基因表達下調［2］。

本研究顯示，喉癌組織中STK15蛋白表達水平明顯高于癌旁正常組織（P＜0.05），而BUBR1蛋白表達水平喉癌組織明顯低于癌旁正常組織（P＜0.05）。提示喉癌中存在STK15蛋白過表達及BUBR1蛋白表達下調，他們可能與喉癌發生、發展密切相關。1998 年 Bischoff等［3］運用 Southern blot發現原位結腸直腸癌細胞中有 STK15 DNA擴增，2004年Rojanala等［4］運用免疫組織化學方法發現28例胰腺癌標本中26例有STK15高水平表達。Tong等［5］運用免疫組織化學、Western blot發現食管鱗狀細胞癌中STK15蛋白量明顯高于正常食管黏膜組織。研究提示，STK15過表達可能有以下幾種原因：（1）STK15基因本身的擴增造成mRNA及蛋白質增加［6］；（2）STK15蛋白的抑制因子—p53基因突變，導致p53蛋白對STK15蛋白抑制作用減弱，導致STK15蛋白無論活性還是表達量均明顯上升［7］。因此，無論什么原因造成STK15在惡性腫瘤中出現的過表達，均可導致中心體異常擴增，引發染色體在分裂中的多極分配及不穩定，進而激活癌基因或使抑癌基因失活，導致腫瘤產生。已經有關于BUBR1突變引發腫瘤的報道，如結腸直腸癌細胞中檢測到BUB1和 BUBR1的突變［2］。Fang等［8］報道了 BUBR1 缺陷也導致對DNA損傷的妥協反應。Futamura等［9］報道BRCAZ基因在一些乳腺癌家族中具有遺傳易感性，它被BUBR1磷酸化后在體內參與有絲分裂檢查點作用。這些發現表明BUBR1基因可能在人類癌癥中有絲分裂檢查點控制和有絲分裂檢查點修復中扮演重要角色。

本研究中免疫熒光共定位實驗表明，喉癌組織中STK15蛋白與BUBR1蛋白在細胞質及細胞核中共定位，提示兩者可能存在相互作用。STK15蛋白與BUBR1蛋白都定位于中心體；這2種蛋白功能失調都可以導致中心體擴增，引起有絲分裂檢控點反應途徑障礙；STK15蛋白過表達和BUBR1蛋白表達下調可促進細胞惡性轉化；惡性腫瘤和實體瘤中經常觀測到G1/S期﹑M期調節蛋白的異常［10］。以上均提示STK15蛋白與BUBR1蛋白可能通過某些作用途徑共同調控有絲分裂檢控點和中心體復制。Morrow等［11］通過蛋白質印跡法﹑時差顯微成像技術等方法研究認為BUB1和STK15共同維持BUBR1介導的對泛素聯接酶—后期促進復合體的抑制作用，但未闡明他們之間的作用機制。STK15蛋白C端含有具備催化活性的保守區域，N端包含一激酶特征性區域稱為Aurora盒，參與激酶與其他蛋白質的相互作用及自身活性調節［1］；BUBR1蛋白是1個對著絲粒張力起反應的多結構域蛋白激酶，有文獻報道［2］使用3步表達策略獲得了1個可溶BUBR1結構，表明BUBR1包括1個KEN盒模體、1個Mad3樣域、1個Bub3連接域和1個激酶域。從蛋白質結構看STK15蛋白N端包含1個Aurora盒，BUBR1蛋白包含1個激酶域。這2個結構都參與激酶與其他蛋白質間的相互作用，故STK15蛋白與BUBR1蛋白存在相互作用的結構基礎。對于蛋白質相互作用的研究，免疫熒光共定位的優點是蛋白質之間的相互作用發生在完整的細胞里，可以反映蛋白質在生理狀態的活動。通過熒光能夠觀察到蛋白質在細胞內的共定位，但免疫熒光共定位存在一定的假陽性率，所以還需免疫共沉淀、酵母雙雜交等其他方法進一步鑒證其可靠性。本課題研究尚未結束，我們下一步將繼續驗證該結論的可靠性及努力探討2種蛋白相互作用的部位及機制。

總之，我們的研究發現，STK15蛋白高表達、BUBR1蛋白低表達可能與喉癌的發生具有相關性，且這2種蛋白在胞質、胞核中共定位，提示兩者可能存在相互作用，共同誘導喉癌的發生，但具體的作用部位及作用機制還需進一步研究。

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