小鼠腎集合管發育中的細胞凋亡與水通道蛋白2的表達

田鶴，王旭，李曉明，郭敏

（1.遼寧醫學院組織學與胚胎學教研室，遼寧 錦州 121001；2.遼寧中醫藥大學組織學與胚胎學教研室，沈陽 110032）

機體從胚胎到發育成熟不僅經歷細胞增殖的過程，同時也伴隨著細胞凋亡。細胞凋亡又稱程序性細胞死亡，在胚胎器官發育中起著重要作用［1］。在細胞凋亡過程中，多種基因家族及其產物起著關鍵性的作用。研究報道，水的轉運在細胞凋亡過程中發揮一定的作用，在集合管中水的轉運主要是通過水通道蛋白 2（aquaporin-2，AQP-2）來完成的［2］。為了進一步探討AQP-2與細胞凋亡及集合管發育的關系，本研究通過免疫組織化學、體視學、電鏡和TUNEL染色法觀察小鼠腎集合管發育過程中AQP-2的表達和細胞凋亡情況，探討兩者的關系及在腎集合管發育過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和光、電鏡標本制備

昆明小鼠，按雌雄比例1∶1同窩飼養，采用檢查陰道栓脫落的方法確定雌鼠受孕時間，以觀察到陰道栓脫落的最早時間計為胚齡（embryonic，E）0 d。記錄受孕時間，然后將孕鼠分籠飼養，每日早8：00和晚5：00觀察生產情況，以觀察到仔鼠出生的最早時間計為生后日齡（neonatal，N）0 d，記錄出生日期。選取 E16、17、18 d 的胎鼠和 N1、3、7、14、21、40 d 的仔鼠，每組取5只鼠。將孕鼠用乙醚麻醉后剖腹取胎鼠，E16，E17，E18 d 的胎鼠剖腹取腎，N1，N3，N7，N14，N21，N40 d仔鼠處死后取腎。左腎入10%中性甲醛固定，常規石蠟包埋切片，厚5μm，用作免疫組化和TUNEL染色。右腎以2.5﹪戊二醛固定，仔鼠腎臟的髓質、胚胎全腎進行樹脂包埋，取樹脂包埋塊，LKB-V型超薄切片機先切半薄切片，經光鏡觀察選擇后進行超薄切片，厚度為50~70 nm。醋酸鈾、枸櫞酸鉛染色，1200EX（JEOL）透射電鏡觀察。

1.2 免疫組織化學方法檢測AQP-2（SABC法）

石蠟切片脫蠟后，經微波修復10 min后滴加3%H2O2室溫孵育10 min，滴加山羊血清封閉液室溫孵育 5 min，加一抗（濃度 1∶100）37℃孵育 1 h，滴加生物素標記的二抗37℃孵育30 min，滴加SABC 37℃孵育30 min，DAB顯色5 min，蘇木精復染、脫水、透明、封片，光鏡下觀察。用PBS代替一抗作陰性對照。抗體稀釋均用pH7.4的PBS。

1.3 檢測細胞凋亡（TUNEL法）

石蠟切片脫蠟后，滴加蛋白酶K（20 mg/L溶于三羥甲基氨基甲烷/鹽酸中）室溫孵育15 min，滴加TUNEL混合溶液（50μL/片），37℃孵育 60 min，滴加轉化劑 POD（50μL/片），37℃孵育 30 min，DAB顯色，蘇木精復染、脫水、透明、封片，光鏡下觀察。用不含末端脫氧核苷酸轉移酶的液體代替TUNEL混合溶液作陰性對照。

1.4 體視學測量

用SABC法染色的切片每個動物的腎隨機取5張，切片在油鏡下按“S”形選取視野，采用方格測試系統，交點計數法測算AQP-2在集合管管腔膜陽性表達的面密度值，公式為：Sv=2Ll=2 Ix/Lc（Lc=ΣPc·a），式中Ix為陽性表達的細胞膜與測試方格的交點數，Pc為落在參照系的測試點數，a為方格的兩點間距離，相當于實際長度的0.1 mm。用TUNEL法染色的切片每個動物的腎隨機取5張，切片在400倍光鏡下按“S”形選取視野，采用方格測試系統，至少計數1 000個細胞，計算陽性細胞所占的百分比。細胞凋亡指數=凋亡陽性細胞數/細胞總數×100%。

1.5 統計學處理

數據以x±s表示，采用單因素方差分析。統計分析用SPSS16.0軟件完成，P＜0.05認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TUNEL染色結果

細胞核中有棕色顆粒者為陽性細胞。N1 d小鼠的集合管上皮中可見陽性細胞（圖1），N7 d時陽性細胞數最多（圖2）。N14 d開始，陽性細胞數量逐漸減少。

圖1 N1 d小鼠腎集合管，可見少量凋亡細胞 TUNEL染色×1 000Fig.1 The apoptotic cells in collecting ducts of mice at N1 d TUNELstaining×1 000

圖2 N7 d小鼠腎集合管，可見大量凋亡細胞 TUNEL染色×1 000Fig.2 The apoptotic cells in collecting ducts of mice at N7 d TUNELstaining×1 000

2.2 電鏡觀察結果（圖3，4）

圖3 N7 d小鼠腎集合管中的凋亡細胞 電鏡×6 500Fig.3 The apoptotic cells in collecting ducts of mice at N7 d Electron microscope×6 500

圖4 N7 d小鼠腎集合管中的凋亡細胞 電鏡×10 000Fig.4 The apoptotic cells in collecting ducts of mice at N7 d Electron microscope×10 000

N1 d即可見到凋亡細胞，N7 d的集合管中凋亡細胞明顯，凋亡細胞的主要表現為細胞體積縮小，核固縮，染色質凝聚成球形、半月狀、月牙狀。

2.3 免疫組織化學染色結果

免疫組織化學染色顯示，E17 d小鼠腎中出現集合管，此時可見AQP-2微弱表達，表達部位為集合管的管腔膜和胞質內，呈棕褐色（圖5）。隨后，在E18 d以及N1，3，7 d的集合管管腔膜和胞質內均有陽性表達的AQP-2，表達強度逐漸增強（圖6）。N14 d至N40 d的集合管中均可見陽性表達的AQP-2，但是表達強度無明顯變化。

圖5 E17 d小鼠腎集合管，AQP-2弱表達 免疫組化×1 000Fig.5 The expression of AQP-2 in collecting ducts was faint at E17 d Immunohistochemistry staining×1 000

圖6 N7 d小鼠腎集合管，AQP-2強表達 免疫組化×650Fig.6 The expression of AQP-2 in collecting ducts was strong at N7 d Immunohistochemistry staining×650

2.4 體視學測量

對TUNEL染色陽性的細胞進行凋亡指數測量，結果顯示N1 d，集合管中細胞凋亡指數為（32.46±3.69）%，到N7 d達到高峰，細胞凋亡指數為（45.36±4.35）%，以后隨著日齡增加凋亡細胞逐漸減少。面密度值測量結果顯示，AQP-2從E17 d的胎鼠開始表達，至N7 d其表達量達最高峰，N7 d至N40 d，AQP-2的面密度值與前一時間點測量值比較無統計學差異（表1）。

表1 小鼠腎集合管不同發育階段細胞凋亡指數以及AQP-2在集合管表達的面密度值（x±s）Tab.1 The apoptosis index and surface area density of AQP-2 in the collecting ducts during development（x±s）

3 討論

細胞凋亡是機體為了維持內環境的穩定，由基因控制的一種自主有序的生理性死亡［3］。在組織、器官的發育過程中，細胞凋亡具有控制細胞數量，消除多余、衰老、異常細胞的作用［4］。凋亡的形態學特征之一是水的流失和細胞體積縮小，細胞體積的縮小會改變細胞內外的滲透梯度，使水通過單純擴散和借助水通道蛋白（如AQP-2）流出細胞，繼之啟動細胞凋亡過程［5，6］。

TUNEL是目前比較常用的探討細胞凋亡的形態學手段，本研究結果顯示，在N1 d的小鼠腎集合管中可見TUNEL陽性細胞，N7 d陽性細胞染色最強，凋亡指數最高，N7 d至N40 d凋亡細胞數量逐漸減少。這表明集合管在N1 d至N7 d是發育的主要階段，雖然細胞數量已夠，但是集合管需要通過細胞凋亡來不斷清除因增生而過剩的細胞，以利于管腔的形成及調控自身的發育速度。N7 d至N40 d，生長和成熟是集合管的主要特點，此期的集合管不再分支，進入發育完善時期［7］。為了鑒別TUNEL陽性細胞是否由于細胞自身分裂形成，本研究應用電鏡技術觀察了集合管中的細胞凋亡現象，結果與TUNEL染色一致。本研究結果顯示AQP-2在E17 d時開始出現表達，部位是集合管主細胞的管腔膜和細胞胞質內，至N7 d表達強度最強，隨后表達強度無明顯改變。對在主細胞管腔膜表達的AQP-2進行的面密度值測量顯示AQP-2表達的面密度值在N7 d達到最大值，之后無明顯變化。這些結果提示在集合管發育過程中，細胞凋亡與AQP-2有一定的相關性。Ma等［8］發現過度表達AQP-2促進細胞體積的縮小和凋亡過程的啟動。Jablonski等［9］也證實在細胞凋亡過程中，過度表達的AQP-2失去活性，喪失對水的轉運能力，使細胞內的離子環境有利于激活caspase等內切酶，進而啟動細胞凋亡，證實了AQP-2與細胞凋亡關系密切，與前人的結果相一致［10，11］。本研究認為N1 d至N7 d是集合管快速發育的時期，此期集合管的細胞數量已足夠其生長需要，為了適應自身的形態變化及有利于管腔的形成，需要以凋亡的形式來清除過剩的細胞。AQP-2的表達與此過程一致，即N1 d表達較強，至N7d達到最高峰，因此，我們推測小鼠腎集合管N1 d至N7 d快速發育期的細胞凋亡是由AQP-2介導的，AQP-2影響集合管的發育過程，關于此過程的分子機制還有待于進一步研究。

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