高效液相色譜法測定脊柱結核化療后組織內利福平和去乙酰利福平的濃度

劉鵬，江建明

（南方醫科大學南方醫院脊柱骨病外科，廣州 510515）

抗結核藥物不易滲入骨病灶［1，2］，而在抗結核藥物治療的基礎上實施手術清除病灶，有利于抗結核藥物滲入病灶，可縮短療程，提高治愈率。因此，在明確病灶切除范圍、徹底清除病灶的前提下，最大限度減少手術創傷，是脊柱結核外科治療的關鍵問題。利福平（rifampicin，RFP）是一線抗結核藥物，國內外對RFP的血藥濃度及原藥檢測已有報道［3，4］。本文利用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）建立了測定患者病椎、血漿及正常骨組織中RFP及其代謝產物去乙酰利福平（25-desacetylrifampicin，De-RFP）的方法，并對不同節段亞健康骨中的原藥及代謝產物進行了檢測，以期為脊柱結核手術方法的改進及化療方案的制定提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 研究對象

1.1.1 最小樣本量的估計：多樣本均數的比較：

1.1.2 研究對象：選取我科2008年1月至12月期間應用2SHRZ/6H2R2Z2短程化療方案（共8個月）［5］（煙肼 0.3、RFP 0.45、鏈霉素 0.75、吡嗪酰胺 1.5）結合手術治療的初治脊柱結核患者36例。男15例，女21例；年齡23～75歲，平均47歲；發病部位：頸椎2例，胸椎5例，胸腰椎10例，腰椎16例，腰骶椎3例。36例患者均具備手術指征，肝、腎功能均正常，入院抗結核治療4周后行手術治療。術前行CT了解病椎情況，其中23例病椎無硬化骨，歸入非硬化骨組，13例含有病椎硬化骨，歸入硬化骨組。

1.2 方法

1.2.1 樣品的采集：術晨統一空腹服藥并記錄時間，術中取患者血液、病灶（包括死骨、干酪樣壞死及膿液）、“亞健康骨”（病灶周圍肉眼觀察正常的骨組織）及髂骨。臨床病理學研究證實，病灶周圍4 mm范圍內的亞健康骨中仍然存在微小病灶［6］，故亞健康骨按病灶邊緣4mm范圍內（A段亞健康骨）、外（B段亞健康骨）取材。每次取樣時間嚴格控制在服藥后2 h以內，以保證各藥血藥濃度達到峰值，提高檢出率。

1.2.2 樣品預處理：靜脈血5 mL置于肝素抗凝玻璃試管（每管加VC 1 mg抗氧化），4 000 r/min離心15 min得血漿，再轉入eppendorf管，置于－70℃待測。病椎及髂骨用濾紙拭血后稱質量（均＞0.5 g），置液氮冷凍后，迅速取出研磨成粉，置于－50℃避光冷凍干燥，再稱質量并計算組織樣本的干濕質量比。分析天平精確稱取200μg，加入甲醇提取液2 mL，渦旋10 min后離心，取上清液制成骨組織提取液，取1 mL放入eppendorf管中留待測定其中的血紅蛋白（hemoglobin，Hb）含量。空白對照血漿為南方醫科大學南方醫院血庫提供的近期健康人血漿，－40℃冷凍保存；空白對照骨取自非結核的脊柱骨折患者前路手術切取的椎體骨，與樣本骨同法制備成空白對照骨組織勻漿。

1.2.3 實驗部分：（1）色譜條件：色譜柱為分析柱shim-pack HRC-C8（250 mm×4.6 mm，5μm），保護柱Eclipse XDB-C18（125 mm×4.6 mm）；流動相為 0.02 mol/L，庚烷磺酸鈉溶液（pH 3.0）-乙腈-甲醇=20∶5∶75，流速為 0.8 mL/min，測試波長 254 nm。（2）試劑與儀器：RFP、VC（標準品由廣州市藥檢所提供），De-RFP參照文獻［7］進行配制，甲醇（色譜純，美國Sigma公司），高效液相色譜儀（LC2010C，日本島津公司），Lc-solution型色譜工作站。（3）建立標準曲線：將空白血漿（圖1）加入標準品溶液稀釋成含RFP 及 DE-RFP 分 別 為 0.1、0.2、0.4、1、2、4、8、16 μg/mL的標準血漿（圖2），以2種藥物的峰面積為X軸，3種藥物的濃度為Y軸做線性分析。得2藥回歸方程：YRFP=3 007.2X+3 714.58，YDe-RFP=2 736.6X+3 380.27。（4）樣本測試：將血漿200μL加入甲醇1 mL沉淀蛋白后離心取上清液，氮氣吹干后甲醇定標到200μL，骨組織提取液則直接取200μL，氮氣吹干后甲醇定標到200μL，進樣體積為20μL。得色譜圖（圖3）后按照峰面積所得值代入標準曲線回歸方程，求得血漿及骨勻漿中的藥物濃度。再根據稀釋比（1∶1 0）、組織的干濕質量比，換算得出髂骨與病椎中藥物的濃度，再由所測的Hb含量（國際血液病學會推薦的HICN法［8］）經校正公式計算求得各組分的校正組織濃度。組織樣本中歸因血污染的藥物濃度由以下公式計算［9］：歸因血污染的藥物濃度［K為組織稀釋因子，S為血漿藥物濃度（μg/mL），Ht為血細胞比容（%）］。

圖1 空白血漿進樣后色譜Fig.1 Chromatogram of blank plasma after injection

圖2 空白血漿添加RFP、De-RFP后進樣色譜圖Fig.2 Chromatogram of plasma with RFP and De-RFP after injection

圖3 組織樣本進樣后色譜圖Fig.3 Chromatogram of tissue sample after injection

1.3 統計學分析

采用SPSS13.0統計學軟件，各組實驗數據以x±s表示，多樣本均數比較采用LSD-t檢驗，檢驗水準 α=0.05。

2 結果

2.1 血漿樣本測試結果

RFP和De-RFP血藥濃度與文獻報道健康人單次服藥的藥時數據相近，36例血液樣本測試結果為：RFPmax=7.77 mg/L、RFPmin=2.70 mg/L、RFPmean=5.13 mg/L；De-RFPmax=7.84 mg/L、De-RFPmin=5.79 mg/L、De-RFPmean=3.74 mg/L。血漿中RFP原藥及代謝產物De-RFP濃度高于髂骨、“亞健康骨”及病椎組織中的藥物濃度，差異有統計學意義（P＜0.01）。

2.2 硬化骨測試結果

含有硬化骨的13例病灶中（包括死骨、干酪樣壞死及膿液）未能測出藥物濃度，A段亞健康骨藥物濃度比B段亞健康骨低，比髂骨中藥物濃度低，差異有統計學意義（P＜0.01）；B段亞健康骨藥物濃度與髂骨接近，差異無統計學意義，見表1。

表1 服藥后2 h硬化骨組抗結核藥物濃度檢測結果（x±s）Tab.1 Concentration of antituberculosis drugs in sclerotic group 2 hours after medication（x±s）

2.3 非硬化骨測試結果

23例非硬化骨的病例病灶中（包括死骨、干酪樣壞死及膿液）藥物濃度明顯低于A、B 2段亞健康骨，差異有統計學意義（P＜0.01），而 A、B 2段亞健康骨與髂骨之間藥物濃度無統計學差異，見表2。

表2 服藥后2 h非硬化骨組抗結核藥物濃度檢測結果（x±s）Tab.2 Concentration of antituberculosis drugs in non-sclerotic group 2 hours after medication（x±s）

2.4 臨床治療結果

全部患者采用2SHRZ/6H2R2Z2（共8個月）方案化療結合結核病椎部分切除、植骨、內固定治療。術中結核病椎切除范圍包括全部的硬化壁及其空洞內的肉芽、壞死干酪樣組織及距病灶邊緣4 mm以內“亞健康骨”。隨訪8～20個月，36例患者術后3個月內結核病全身癥狀消失，血沉（erythrocyte sedimentation rate，ESR）、C 反應蛋白（C-reactive protein，CRP）轉為正?；蚧菊＃骄补墙缑嫒诤蠒r間5個月，隨訪1.5年后，除1例因術后3個月內自行停藥復發以外，其余無復發。

3 討論

利福平仍是當今一線抗結核藥物，目前已知RFP的體外最低抑菌濃度（MIC）為0.025~0.05 μg/mL［10］，公認的有效殺菌濃度應為試管內MIC的10倍以上［11］。RFP口服吸收可達 90%～95%，于 1～2 h血藥濃度達峰值，易滲入機體組織、體液（包括腦脊液）中，有效濃度可維持約6 h。RFP在肝臟中可在自身誘導微粒體氧化酶的作用下迅速去乙?；蔀榫哂锌咕钚缘拇x產物De-RFP。t1/2為2～5 h，服藥后1.5～4 h血藥濃度達峰值。以往已有采用液相色譜法檢測血液及骨骼中RFP的報道［12］，而本研究采用HPLC法建立了可檢測患者病椎各部位、血漿、正常骨組織及不同節段的亞健康骨中RFP原藥及其代謝產物De-RFP的方法。13例硬化骨病灶中未能檢測出藥物濃度，B段亞健康骨中RFP藥物濃度達到MIC的10倍以上（即達到有效殺菌濃度水平），與自身對照的髂骨濃度相當；而A段亞健康骨中的RFP藥物濃度卻在MIC的10倍以下。23例非硬化骨的病灶中藥物濃度均在MIC的10倍以下，A、B 2段亞健康骨中RFP的藥物濃度均達到MIC的10倍以上。結果提示，硬化骨可能起阻隔藥物滲透的屏障作用，外圍健康椎體骨組織中高濃度的RFP及其代謝產物De-RFP難以穿越此層結構滲透到病灶當中，而距硬化骨較近的A段亞健康骨中的藥物濃度仍較低，較遠的B段亞健康骨中的藥物濃度相對較高。

目前我國結核病人數居世界第2位，耐藥率從20世紀90年代漸呈上升趨勢，并有難治的耐多藥（MDR-TB）出現［13，14］。據文獻報道，獲得性耐多藥占79.4%，其中又以醫源性不規則用藥史者為多［15］?；熍浜霞怪Y核病灶清除術治療不僅直接清除了壞死的病灶，還打通了阻礙血液運載藥物進入病灶的板障，提高了病灶局部的血藥濃度。及時檢測患者化療后的血液及骨骼中的藥物濃度，不僅是化療本身的重要參考，也是清除病灶的依據。本研究所建立的HPLC檢測方法有助于明確術中亞健康骨切除的范圍，為脊柱結核病灶清除術治療提供定量依據。本方法不僅可檢測RFP原藥血藥濃度，還可檢測其代謝產物De-RFP的濃度，檢測這種具有殺菌活性和肝臟毒性的物質對結核化療患者的藥物濃度監測及安全用藥有一定的臨床意義。本研究結果表明，包裹在硬化壁內的病灶難以達到有效的藥物濃度，手術應徹底清除包括死骨、肉芽、壞死、干酪樣組織的病灶；鄰近的亞健康骨內藥物濃度亦相對較低，這一部分亞健康骨也應予以清除；而對無硬化骨的病例手術清除病灶時直達亞健康骨，亦可取得良好的療效。

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