結核病患者血清中Small RNAs表達譜分析

鐘球 周琳 錢明 陳濤 陳亮 李海成

(廣東省結核病防治研究所 廣州 510630)

結核病患者血清中Small RNAs表達譜分析

鐘球 周琳 錢明 陳濤 陳亮 李海成

(廣東省結核病防治研究所 廣州 510630)

目的了解結核病患者血清中Small RNA(sRNA)表達譜的特征,為從Small RNA角度探討結核病發生、發展的調控機制奠定基礎>。方法采用Solexa深度測序技術得到包括miRNA、siRNA 、piRNA 、rRNA 、tRNA 、snRNA 、snoRNA 、repeat associate sRNA 、exon 或 intron 降解片段等在內的所有Small RNA。通過與已知數據庫進行比對、尋找樣品與數據庫之間在基因組位置上的overlap等方法,對sRNA進行注釋,同時選取沒有被注釋上的 sRNA,使用華大自主開發的軟件Mireap預測novel miRNA>。結果非結核病組血清中發現109 630種、2 759 795條Small RNA,其中候選miRNA種數為84、候選miRNA總表達量為1 433;結核病組血清中發現97614種、1 452119條Small RNA,其中候選miRNA種數為65、候選miRNA總表達量為755>。結論結核病人與非結核病人血清中的Small RNA表達譜存在種類與數量上的差異。

結核/血液;微 RNAs;基因表達

Small RNA是生物體內一類重要的特殊分子,在生物進化過程中高度保守。他可以誘導基因沉默,參與細胞生長、發育、基因轉錄和翻譯等諸多生命活動的調控過程,并已被證實參與和調控包括時序發育、細胞凋亡、神經元發育、激素分泌等在內的多種生理過程[1]。Micro RNA(miRNA)是目前研究最為廣泛的一類內源性非編碼單鏈小分子RNA,長度在22 nt左右[2-3],進化上高度保守。是真核生物基因表達中的一類負調控因子,通過堿基互補配對原則與靶基因mRNA結合,在轉錄后水平上使基因沉默,從而使mRNA降解或抑制mRNA翻譯[4],也能在轉錄水平上通過決定目標基因染色體位點的甲基化而起作用。

檢測周期長、高耐藥率是結核病醫務工作者面臨的兩大挑戰。鑒于血清學診斷的簡便、快速以及其在許多傳染病診斷中所發揮的重要診斷作用,血清學診斷始終是結核病免疫學關注的焦點。但由于體液免疫與結核病發生、發展與轉歸的相關性仍不明晰,目前針對結核分枝桿菌各種抗原的抗體檢測臨床價值受限[5-6]。另辟蹊徑尋找結核病血清學診斷標志物是當今熱門課題之一。基于Solexa高通量測序技術的小 RNA數字化分析,采用邊合成邊測序(SBS-sequencing by synthesis),可減少因二級結構造成的一段區域的缺失。并具有所需樣品量少,高通量,高精確性,擁有簡單易操作的自動化平臺和功能強大等特點,一次性獲得數百萬條小分子RNA序列,能夠快速全面地鑒定該物種在該狀態下的小分子RNA和發現新的小分子RNA,構建樣品之間的小分子RNA差異表達譜。本文利用Solexa高通量測序技術,分析非結核病組和結核病組血清中Small RNA表達譜的差異。為從血清Small RNA這個角度對結核病的發生、發展;耐藥結核病的發生機制;結核分枝桿菌與機體的相互作用等方面進行研究奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 樣本來源 27例涂陽肺結核患者(下稱“結核病組”,包括：男19例、女8例,年齡在 22～87歲之間,平均42歲)血清由廣州市胸科醫院提供,25例健康志愿者血清取自本單位職工(下稱“非結核病組”,包括：男 11例、女 14例,年齡在 25～50歲之間,平均34歲)。

1.1.2 樣本采集和保存 抽取靜脈血4～5 ml置于2支真空促凝管中,室溫靜置約30 min,4 000轉/min離心5 min,吸取血清均分至2支2 ml低溫凍存管中,-70℃冰箱保存備用。

1.1.3 試劑與儀器 一次性真空促凝管購自廣州陽普醫療科技股份有限公司;Total RNA Purification Kit(T RK-1001)為美國LC Sciences公司產品;從總RNA中分離sRNA、RT-PCR擴增、cDNA樣品準備、DNA成簇擴增及測序等試劑使用Illumina公司配套產品;序列測定應用Illumina HiSeqTM 2000測序儀系統。

1.2 方法

1.2.1 血清總RNA提取 從-70℃冰箱取出每例備用血清樣本1支,置室溫待其溶解;從病例組、對照組的樣本中各取1 ml血清按組別分別加至2支50 ml離心管中,制備病例組、對照組混合血清各1管;嚴格按LC Sciences RNA提取試劑盒說明書提取血清總RNA。

1.2.2 血清Small RNA測序 血清sRNA分離、純化、cDNA文庫建立、擴增與測序、生物信息學分析由深圳華大基因研究院協助完成,實驗操作嚴格按照試劑和儀器說明書進行。主要實驗流程包括：從總RNA中分離sRNA→5′接頭連接→3′接頭連接→RT-PCR擴增→sRNA文庫的純化→文庫的檢測→DNA在Cluster Station成簇擴增→Illumina HiSeqTM 2000測序儀上的測序→對10～30nt sRNA干凈序列采用GenomeStudio軟件進行生物信息學分析,得到兩種人群血清中Small RNA的表達譜。

2 結果

2.1 數據質量及長度分析 非結核病組,有11 059 438條Small RNA序列被測定,其中高質量測序片斷10 639 162條。將高質量的測序片段去接頭、去污染后得到干凈序列2 759 795條。結核病組,有10 174 571條Small RNA序列被測定,其中高質量測序片斷9 732 428條。將高質量的測序片段去接頭、去污染后得到干凈序列1 452 119條。然后對干凈序列的各種血清Small RNA進行表達分析,一般來說,Small RNA的長度區間為18～30nt,長度分布的峰能幫助我們判斷Small RNA的種類,如miRNA集中在21或22nt,siRNA集中在24nt,piRNA集中在30 nt。2組人群血清中10～30nt的Small RNA的表達豐度見表1,其分布譜型見圖1。

表1 不同長度(nt)血清Small RNA的表達豐度(%)

圖1 2組人群血清中不同長度Small RNA的表達譜型圖

表2 非結核病組血清中Small RNA在各類中的分布

2.2 Small RNA分類注釋 將所有Small RNA與各類RNA的比對、注釋情況進行總結。在以上各注釋信息中,有可能存在一個Small RNA同時比對上2種不同的注釋信息的情況。為了使每種Small RNA有唯一的注釋,按照rRNAetc＞known miRNA＞repeat＞exon＞intron的優先級順序將Small RNA遍歷,沒有比上任何注釋信息的Small RNA用unann表示。由于 rRNAetc是由 NCBI Genbank和Rfam 2個數據庫比對所得,規定這2個數據庫間的優先級為Genbank＞Rfam[7]。分類注釋結果中的rRNA總量可以作為一個樣品的質控標準：一般情況下質量較好的動物樣品中rRNA總量所占比例應低于40%。2組人群血清中Small RNA分類注釋結果見表2、表3。

2.3 新miRNA前體預測及不同長度候選miRNA首位基因偏向性分析 miRNA前體的標志性發夾結構,能夠用來預測新的miRNA。深圳華大基因研究院開發出了一套miRNA預測軟件Mireap,通過對截取一定長度Small RNA比對上的基因組序列,探尋其二級結構及Dicer酶切位點信息、能量等特征,從所得到的Small RNA中篩選出有可能成為新的miRNA的片段,其統計結果見表4。不同長度的候選miRNA的首位點堿基分布統計分析見表5、表6,所有候選miRNA各位點堿基分布的統計見表7、表8。通過對不同長度的候選miRNA的首位點堿基分布及所有候選miRNA各位點堿基分布的統計,可根據已知miRNA的堿基偏好性的統計,對預測結果的準確性進行評價。

表3 結核病組血清中Small RNA在各類中的分布

表4 兩種人群血清中新miRNA前體預測統計

表5 非結核病組血清中不同長度候選miRNA首位堿基偏向性

表6 結核病組血清中不同長度候選miRNA首位堿基偏向性

表7 非結核病組血清中候選miRNA各位點堿基分布的統計

表8 結核病組血清中候選miRNA各位點堿基分布的統計

續表8

3 討論

Small RNA是生物體內一類重要的功能分子,它的功能是誘導基因沉默,調控細胞生長,發育,基因轉錄和翻譯等生物過程。人們一般將其歸為三類：微 RNA(miRNA)、小干擾 RNA(siRNA)和與PIWI蛋白相互作用的 RNA(piRNA)[8]。其中：miRNA是一種進化上高度保守、大小約20～25個堿基的單鏈小分子RNA,可通過調控基因表達等方式廣泛參與機體的發育、細胞增殖、細胞分化、細胞凋亡、免疫調節等過程[9];siRNA是一些雙鏈的RNA在細胞內被特異地切割并加工成長度為21～25核苷酸的小分子 RNA,它能結合與之相似的mRNA分子抑制相應蛋白質的表達而致基因沉默[10];piRNA的長度為26～31個核苷酸,只存在于哺乳動物的睪丸中,推測與RNA沉默作用有關[11]。由此可見,Small RNA在生命活動中發揮著重要的作用。目前也有眾多的研究顯示Small RNA參與了許多疾病的病理過程,其中與腫瘤關系的研究更成為近年來生命科學的熱點,它們與多種惡性腫瘤如肺癌、乳腺癌等之間的關系被相繼報道[12-14]。

循環系統中的Small RNA現在也進入了研究工作者的視線,張玉靜等[15]報告分泌的miRNA能夠以信號分子的形式調節細胞間的信息交流。在人血細胞和培養的THP-1細胞內,miR-150被選擇性的包裝成超微小囊,并且分泌活躍。THP-1起源的超微小囊能夠進入并把miR-150傳遞給HMEC-1細胞。miR-150可以高效的降低c-Myb的表達并且加強HMEC-1細胞的移行。Mitchell等和其他2個工作組研究發現,循環miRNA有希望成為前列腺癌、妊娠、卵巢癌的生物學標記[16-18]。通過分析正常生理條件和其他各種疾病狀態下血清中miRNA表達譜的特征,發現血清中的miRNA并不只來源于血細胞,也來源于受疾病直接影響的組織和細胞[19]。有意思的是血清來源的miRNA可以耐受RNaseA的消化作用,這與組織和細胞提取的RNA不同[19]。所以我們可以通過分析不同狀態下人群血清中的miRNA表達差異,篩選出具有診斷意義的miRNA。同時這也是對細胞信號轉導內容的補充。我們可以分析這些差異表達的miRNA出現的機制及其對機體的影響,從而使我們可以更詳細的認識結核病,提供治療結核病新的方法思路。

綜上所述,結核病人群體內Small RNA表達譜發生了變化。這些差異表達的Small RNA可能通過調節對應靶基因而導致結核病發生發展及其轉歸、或者是與耐藥結核病發生有關。本項目研究只是結核病人群血清中Small RNA表達譜的初步分析,這將為后續對研究Small RNA與結核病之間的關系奠定基礎。

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Analysis of the expression profile for serum small RNAs from tuberculosis patients

Zhong Qiu,Zhou Lin,Qian Ming,Chen Tao,Chen Liang,Li Haicheng
(Guangdong Institute for Tuberculosis Prevention and Treatment,Guangzhou510630,China)

ObjectiveT o analyze the expression profile of serum small RNAs(sRNA)from tuberculosis(TB)patients,and find a new way to study the regulatory mechanisms in the process of tuberculosis.MethodsSmall RNAs from Solexa deep sequencing covered almost every kind of RNA,including miRNA,siRNA,piRNA,rRNA,tRNA,snRNA,snoRNA,repeat associated sRNA and degraded tags of exon or intron.By comparing our sequences with those in databases and picking out the overlap on genome location between our data and the databases,sRNAs can be annotated into different categories.Those which can not be annotated will be used to predict novel miRNA by the self-developed software Mireap.ResultsIn the sera from non-TB patients group,109 630 different types containing 2 759 795 sequences of small RNAs were found,,in which there were 84 different types containing 1 433 sequences of miRNA candidates.In the sera from TB patients group,97 614 different types containing 1 452 119 sequences of small RNAs were found,in which there were 65 different types containing 755 sequences of miRNA candidates.ConclusionsThe expression profiles of serum small RNAs are different between TB patients and non-TB patients.

tuberculosis/blood;micro RNAs;gene expression

Zhong Qiu(gdtb_bg@vip.163.com)

鐘球(gdtb_bg@vip.163.com)

1.廣東省自然科學基金(9151051501000003);2.國家十一五重大專項：結核病發病模式的研究項目(2008ZX10003-007)。

2011-03-28)

(本文編輯：范永德)