正交設計優化山茱萸總苷的微波提取工藝

喻蘇青,陳 凱,婁家豪,宋必衛,齊敏友

(浙江工業大學藥學院,浙江 杭州 310032)

山茱萸系山茱萸科植物Cornus officinalis Sieb.et Zucc.的干燥成熟果實,始載于《神農本草經》,有良好的溫腎壯陽之功,《藥性論》載:“補腎氣,興陽道,堅陰莖,添精髓”.山茱萸總苷是山茱萸主要活性成分之一,可降低鏈脲佐菌素(STZ)所致糖尿病大鼠肌漿網鈣泵(SERCA2a)的表達[1];顯著降低大鼠血糖、糖化血清蛋白,提高肝糖原含量[2]等.山茱萸總苷的提取方法很多,如索氏提取法、超聲提取法[3]、超臨界流體萃取法[4]等.自Ganzler首次將微波輔助技術(microwave-assisted extraction,MAE)應用于植物樣品提取,MAE技術[5-6]日趨成熟.筆者就該項技術應用于山茱萸總苷的微波提取工藝進行研究,并以熊果酸為標示量[7],HPLC法測定其含量.本實驗提高了山茱萸總苷的提取率,建立了山茱萸總苷的微波輔助萃取工藝,操作簡單,生產成本降低,有利于山茱萸的開發利用.

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

島津LC-10A高效液相色譜儀(日本島津).萬能粉碎機(廣州市大祥電子機械設備有限公司).電子分析天平(Mettler Toledo公司).格蘭仕微波爐(格蘭仕公司).RE52CS旋轉蒸發儀(上海亞榮儀器廠).熊果酸對照品(購自中國藥品生物制品檢定所);山茱萸藥材(購自胡慶余堂);甲醇為色譜純;水為重蒸水;其他試劑均為分析純.

1.2 山茱萸總苷含量的HPLC測定

1.2.1 色譜條件

色譜柱為Kromasil-C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μ m),流動相為 V(甲醇)∶V(水)=9∶1;流速1.0 mL/min,柱溫25 ℃,檢測波長215 nm,進樣量20 μL.

1.2.2 樣品的處理

山茱萸60℃恒溫干燥,粉碎,過60目篩,用烘箱烘至恒重保存.精密稱定樣品約3 g于250 mL錐形瓶中,分別按設定的微波提取條件安排實驗,抽濾,濾液55℃減壓濃縮得浸膏.浸膏溶于50 mL純化水,以石油醚(60～90℃)1倍量萃取 2次,再以1倍量水飽和正丁醇萃取3次,合并正丁醇萃取液,減壓濃縮至無醇味,備用.

1.2.3 標準曲線的制備

精密稱取干燥至恒重的熊果酸標準品3.1 mg,用流動相定容至5 mL量瓶中,即得620 μg/mL的對照品溶液.分別取5,10,15,20,25 μL的對照品溶液進樣,按上述色譜條件進行測定,測得峰面積.以熊果酸量(μg)為橫坐標,峰面積為縱坐標,繪制標準曲線,得回歸方程:Y=338 883X+16 393(r=0.999 8).結果顯示 ,熊果酸在 3.10 ～ 15.50 μg 范圍內與峰面積呈良好線性關系.

專欄是編輯稿件的重要方式之一，地方科技期刊的編輯不僅要深入挖掘文章質量，還要主動向有學術影響力的作者群體約稿，準確定位某一學科特點與熱點，策劃籌辦特色專刊、專欄，邀請作家專門為專欄目撰寫文章。將編輯的主動性、創造性與讀者需求結合，通過?？?欄培育屬于自己的刊物特色，增強科技期刊的學術影響力與競爭力，打造名牌欄目、名牌期刊，占領學科發展高地?，F代化的經營意識與學術影響力的充分結合為地方科技期刊的品牌建設注入了新的發展動力，通過籌辦特色學科?？?專欄，擴大期刊知名度的同時還可以提升編輯的組稿能力與專業水準。[7]

將同一熊果酸對照品溶液,連續重復進樣6次,每次20 μL,記錄峰面積.熊果酸峰面積 RSD%為1.1%(n=6),結果顯示儀器的精密度良好.

1.3.5 光波組合對山茱萸總苷提取率的影響

1)EL1262帶超采樣功能的數字量輸入模塊用于采集編碼器同步脈沖，采樣速度快，能夠滿足卷煙機生產速度要求；

精密稱定約20 mg浸膏,用流動相定容至10 mL,搖勻,用0.45 μ m微孔濾膜過濾,取續濾液進樣,按外標法測定.色譜圖見圖1.

圖1 溶液的色譜圖Fig.1 Chromatograms of control solution(a)and sample solution(b)

1.3 微波提取的單因素實驗

由于微波功率主要影響升溫速度,功率越大提取時環境溫度升高越快,提取效率也會相對地越高.但功率越大有機試劑也越容易沸騰,不易控制,所以選取320 W條件試驗.

由圖5可知:山茱萸總苷的含量隨著微波時間的增加而明顯升高,55%微波和45%光波時間組合時達最高值.所以選擇55%為最適微波光波時間比.

最近幾年來，湖北省把鄂州市當作全省城鄉一體化的試點市區來進行建設。鄂州市也充分利用了這次試點的機會，將構建和諧社區作為建設的重點，在和諧社區建設方面取得了長足的發展，受到了湖北省委、省政府的高度贊揚。[2]然而，鄂州市在和諧社區建設中物業管理方面仍存在一些問題，需要解決。

1.2.4 精密度測試

在提取時間分別為30,40,50,60,120,180,240 s,液固比為 25 mL/g,在功率為320 W 條件下,以95%乙醇微波提取,測定并計算提取率,見圖2.

圖2 時間對收率的影響Fig.2 Duration of microwave radiation

由圖2可以看出:在提取時間為30～60 s時,提取率隨時間的延長而逐漸升高,在60 s以后基本趨于平衡.可能是因為所含皂苷已基本溶出,所以增加提取時間不能使提取率升高.所以選取提取時間為60 s.

1.3.2 不同溶劑對山茱萸總苷提取率的影響

1)靶板成坑的體積Vc與彈丸的動能Ep近似成比例關系，即,Vc≈KEp，其中K為常數，依賴于彈-靶材料的性質。

分別以 95%乙醇、丙酮、氯仿、正丁醇、乙酸乙酯為提取液,液固比為 25 mL/g,320 W功率下微波提取60 s,測定并計算提取率,見表1.

表1 溶劑對收率的影響Table 1 Selection of solvents

由表1可知:95%乙醇和正丁醇部分皂苷收率較高.但是,正丁醇為毒性溶劑,而且沸點高,所以選擇相對安全而又低沸點的95%乙醇為提取溶劑.

根據給排水、消防、電氣等工藝專業的需求，配電裝置樓的某些部位墻體需要安裝設備箱，通常是消火栓箱、配電箱、控制箱等，消火栓箱常見最大尺寸為1 600 mm(高)×700 mm(寬)×240 mm(厚)，配電箱常見尺寸有450 mm(寬)×550 mm(高)×190 mm(深)。前文所述墻體較薄，在厚度上不能滿足箱體安裝要求，如果箱體局部突出墻體，既不美觀又存在安全隱患，所以，安裝有箱體的隔墻優化設計為雙排龍骨，將箱體內嵌于墻體中間。箱體安裝處往往埋管密集，經細化設計后，墻體即可滿足箱體安裝要求，又可在雙排龍骨空隙中埋管，也避免了埋管過多對單層龍骨整體性的破壞。

1.3.4 液固比對山茱萸總苷提取率的影響

在乙醇體積分數分別為30%,50%,70%,80%,95%,99%,液固比為25 mL/g,提取時間為1 min的條件下進行微波提取,測定并計算提取率,見圖3.

當收貨員收完貨貼好標簽后，進行轉運環節。這一過程是叉車司機按照系統所給的信息將貨物放入相對應的貨槽中。但在中途會發生一些錯失，如：將貨物放在相鄰的位置，而不是正確的貨槽里；標簽有所遺失，導致該貨物成為無信息貨物，無法第一時間放入正確的貨槽中。

圖3 乙醇體積分數對收率的影響Fig.3 Concentration of ethanol

5、加強田間管理：大豆發生根腐病，主要是根的外表皮（切皮部）完全腐爛，影響對水分、養分的吸收。因此，及時趟地培土到子葉節能使子葉下部長出新根，使新根迅速吸收水分和養分，緩解病情，這是治療大豆根腐病的一項有效農業措施。

1.3.3 乙醇體積分數對山茱萸總苷提取率的影響

由圖3可知:山茱萸總苷的含量隨著乙醇體積分數的升高而逐步上升.由于無水乙醇價格相對較高,為了節約成本,選擇95%乙醇為提取溶劑.

因溶劑太少無法浸沒物料,所以選擇在料液比為10,15,20,25,30 mL/g,乙醇體積分數為95%,功率為320 W,提取時間為60 s的條件下進行提取,測定并計算提取率,見圖4.

圖4 液固比對收率的影響Fig.4 Solvent to material ratio

由圖4可知:總苷收率隨著液固比的增加而升高,當超過20 mL/g時,收率明顯下降.因此選取20 mL/g為最佳液固比.

1.2.5 樣品的測定

在功率為320 W,20 mL/g的95%乙醇,微波光波時間比值分別為100∶0,55∶45,30∶70,0∶100的條件下,提取1 min,測定并計算提取率,見圖5.

圖5 微波與光波的時間比值對收率的影響Fig.5 Light/wave time ratio

1.3.1 微波萃取時間對山茱萸總苷提取率的影響

1.4 正交試驗優化微波提取工藝

在微波單因素試驗的基礎上,對影響山茱萸總苷提取率的主要因素乙醇體積分數、料液比、微波提取時間以及微波光波時間比值進行L9(34)正交實驗,設計見表2,結果見表3.

表2 正交實驗的因素水平表Table 2 Factors and levels

表3 正交試驗結果Table 3 Results of L9(34)orthogonal test

由表4可知:采用微波提取法提取山茱萸總苷,液固比和時間對提取率有顯著影響,光波比和乙醇體積分數沒有顯著性.根據極差R值可以得出,4個因素對山茱萸總苷提取率影響的主次順序為C＞A＞D＞B,最優水平為 C3A1D2B2,即液固比25 mL/g,50 s,55%光波組合,70%乙醇.通過試驗證實在該條件下總苷提取率為3.02 mg/g.

表4 正交試驗方差分析表Table 4 Analysis of variance about total extraction rate

1.4 最佳條件下的重復性和回收率實驗

1.4.1 重復性實驗

我盯著手里的武器，在我的人生中，從沒有料到會握著一把槍，更別說射擊了。我感覺這很危險，好像只是碰著它，就可能隨時走火傷及他人。

文道、技道關系決定作品價值和作者人生境界的高下，這是陸游否定晚唐詩的根本理論依據；而指晚唐詩“(詩格)卑弱”，也正是責晚唐詩人人格的卑弱。實際上都未出儒家正統詩學觀的范圍。他在《答陸伯政上舍書》中曾說：“古聲不作久矣！所謂詩者，遂成小技；詩果可謂之小技乎？學不通天人，行不能無愧于俯仰，果可言詩乎？”〔1〕74陸游也認為：“大抵詩欲工，而工亦非詩之極也。鍛煉之久，乃失本旨；斲削之甚，反傷正氣。”〔1〕244這也是他否定晚唐詩的詩學理由。亦基于此，他才會說“亦莫雕肝肺，吟哦學郊島”(《晨起》)，“晚唐諸人戰雖鏖，眼暗頭白真徒勞”(《記夢》)！

取同一批次的山茱萸樣品5份,在最佳條件下進行萃取,分別測定各自的總苷含量,結果表明其相對標準偏差為1.68%.

1.4.2 加樣回收率實驗

收到U盤的程瀚大為光火，立即指示市公安局副局長張某不辦立案手續、直接動用技偵手段追查此事。令人咋舌的是，負責處理這個案件的一名女警就是視頻中的“女主角”。

準確稱取一定量樣品9份,加入不同量的熊果酸對照品溶液,在最佳條件下進行萃取,萃取物按試驗方法進行顯示,測定峰面積,計算回收率.結果表明回收率在99%～102%之間,說明此方法有較好的準確度.

1.5 微波法與傳統提取方法的比較

本實驗用乙醇浸提法和超聲波萃取法進行對比實驗.乙醇浸提法:液固比25 mL/g,95%乙醇磁力攪拌下浸泡48 h,過濾,取濾液,連續提取3次,合并濾液,減壓濃縮.共萃取3次,計算平均提取率.超聲波輔助提取法:液固比30 mL/g,95%乙醇,45 kHz頻率,超聲萃取15 min.共萃取3次,得平均提取率.以上各種萃取方法結果對比列于表5中,可以看出,微波提取法僅用1 min卻比乙醇浸提48 h的提取率高.從節能、省時和試劑節約等多方面角度看,微波法優于乙醇浸提法和超聲波萃取法.

表5 與其它提取方法的比較Table 5 Comparison of MAE with other extraction methods

2 結 論

主要對微波輔助法萃取山茱萸總苷進行了初步研究,正交試驗表明:影響山茱萸總苷提取率的主要因素為液固比和時間.在功率300 W條件下,最佳提取工藝條件:液固比 25 mL/g,提取時間50 s,微波光波時間比值55%,乙醇體積分數70%,該條件下總苷提取率為3.02 mg/g.由重現性實驗和加樣回收實驗的結果可以看出,建立的萃取和測定方法可靠、準確及簡便.微波輔助萃取與乙醇浸提法的比較表明:微波輔助法具有快捷、高效和節能等特點,說明工藝可行.

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