超臨界色譜拆分6種唑類手性農藥

馮碩立,徐明仙,高偉亮,林春綿

(1.浙江工業大學 生物與環境工程學院,浙江 杭州 310032;2.杭州職業技術學院 化工系,浙江 杭州 310018)

手性異構體(對映體)的存在是自然界的一種普遍現象,在現有的農藥品種中,分子中含有手性原子的化合物越來越多,據文獻報道,市場上出售的農藥化學品中約有30%～40%是具有手性的[1].目前主要的手性農藥有:有機磷類殺蟲劑,擬除蟲菊酯類殺蟲劑,三唑類殺菌劑,酰基氨基丙酸類殺菌劑等.手性農藥對映體在生物環境中所表現出的藥效學和藥代動力學存在很大的差異,例如三唑醇的4個光學異構體殺菌能力完全不同,左旋體的藥效高于右旋體,毒性還比右旋體低.由于單一對映體農藥具有高效低毒等特點,使其在市場上的需求得到迅猛增長,利用對映體活性的不同進行新的農藥的開發具有廣闊的前景.目前,獲得單一對映體的技術主要有對映體選擇性合成與對映體分離.對映體選擇合成技術上困難很大且成本太高,因此手性農藥對映體分離技術日益引起人們的關注[2-4].目前,HPLC,SFC等在手性對映體分離領域中均發揮著重要作用.其中,HPLC使用很普遍,又有大量的手性固定相(CSPs)可供選擇,是最常用的色譜分離技術.但是HPLC也存在分析時間過長,分離效率不高等缺陷,而SFC(一種流動相溫度、壓力均高于或略低于臨界點的色譜技術)與常規的HPLC相比,具有體系的粘度低、擴散和傳質速率高等優點,引起了許多學者的濃厚興趣.他們對 HPLC和SFC做了一些對比研究[5,6],發現SFC的分離效率更高、分析時間更短,可以有效地彌補HPLC的不足.

三唑類農藥作為一類高效殺菌劑,能有效保護谷物、大豆、水果等農作物免受細菌侵害,在農業生產中的應用非常廣泛[7].三唑類農藥大多擁有手性,這對它們的生物活性產生了很大的影響.目前,人們使用HPLC拆分了很多三唑類農藥,使用的手性固定相有多糖類、環糊精類、大環抗生素類手性固定相[8-10],但使用SFC拆分三唑類農藥的文獻卻很少.本實驗采用SFC在Chiralpak IB手性柱上拆分了三唑酮、戊唑醇、己唑醇、烯效唑、腈菌唑、惡醚唑6種三唑類農藥,并分別考察了甲醇、乙醇、異丙醇三種醇類改性劑對手性分離結果的影響.

1 材料與方法

1.1 藥劑和試劑

三唑類農藥(圖 1):腈菌唑、三唑酮、己唑醇、戊唑醇、烯效唑和惡醚唑.所有農藥純度大于95%,溶解在乙醇中(由溫州一帆化工有限公司提供).

圖1 6種三唑類農藥的結構式Fig.1 Structure of the six triazole fungicides

醇類改性劑:色譜甲醇、乙醇及異丙醇(天津四友).

液態CO2:干冰級CO2(杭州今工特種氣體有限公司).

1.2 實驗設備

超臨界色譜型號為Thar SD-ASFC-2 system,配有UV/VIS-151紫外檢測器和Rheodyne 7410手動進樣閥(以上設備購自Thar Technologies,Pittsburgh,PA,USA).SFC系統控制軟件:superchrom software.

手性色譜柱:Chiralpak IB(250 mm×4.6 mm ID,5 μ m);手性選擇基團:鍵合在硅膠上的纖維素-(3.5-二甲基苯基氨基甲酸酯).

1.3 色譜條件和色譜參數計算

流動相主體為超臨界CO2,改性劑有:甲醇、乙醇、異丙醇.流動相流速:2.0 mL/min.SFC系統溫度:36℃.紫外檢測波長:230 nm.

色譜柱死體積(t0)用1,3,5-三叔丁基苯(tributylbenzene)測定:1.9 min.第一個洗脫峰的保留因子:k′1=(t1-t0)/t0,第二個洗脫峰的保留因子:k′2=(t2-t0)/t0.分離度:Rs=(t2-t1)/(W1+W2).其中t1和t2分別為第一個洗脫峰和第二個洗脫峰的保留時間;W1和W2分別是第一個洗脫峰和第二個洗脫峰的半峰寬.

2 結果與討論

如圖1所示,6種三唑類農藥都擁有氯苯基和1,2,4-三唑基團,除了惡醚唑有兩個手性中心,4個對映體外,其他5種農藥都只有1個手性中心,2個對映異構體.考慮到6種農藥結構上具有一定的相似性,我們嘗試用一根手性柱(Chiralpak IB)在SFC上拆分這6種農藥.

2.1 醇類改性劑的影響

由表1,2可知,除了惡醚唑,其他5種農藥的拆分效果都比較理想,保留時間小于10 min,分離度大于1.當醇類改性劑由異丙醇變為甲醇時,由于流動相極性增強,農藥的保留時間縮短.而提高醇類改性劑的比例,也會增強流動相的極性,農藥的保留變弱,同時還會降低對映體的分離度.使用同一種流動相組合,6種農藥的保留時間各不相同,由長到短依次為戊唑醇、惡醚唑、腈菌唑、己唑醇、烯效唑和三唑酮.其中己唑醇和烯效唑的分子結構非常相似,保留時間也很接近.可能是由于兩種農藥分子中苯環上氯原子取代個數的不同造成了兩者保留時間的微小差別.

表1 腈菌唑、三唑酮和己唑醇的拆分結果Table 1 Separation results of myclobutanil,triadimefon,hexaconazole

表2 戊唑醇、烯效唑和惡醚唑的分離結果Table 2 Separation results of tebuconazole,uniconazole,difenoconazole

己唑醇和腈菌唑的拆分效果最為理想,使用改性劑甲醇、乙醇或異丙醇都能使它們的對映體實現基線分離,在高濃度的改性劑條件下也能獲得很高的分離度.尤其是腈菌唑,當甲醇的濃度提高到20%時,分離度仍然有6.71,因此,在拆分這兩種農藥時,可以使用高濃度的改性劑以縮短其保留時間.兩種農藥的最佳拆分條件分別為V(CO2)∶V(乙醇)=4∶1和 V(CO2)∶V(甲醇)=4∶1.

使用CO2和乙醇的流動相組合可以順利拆開烯效唑和戊唑醇兩種農藥,但卻不是最理想的選擇.以5%的甲醇作為改性劑,可以在10分鐘內基線分離烯效唑的兩個對映體,分離度為2.3.用V(CO2)∶V(異丙醇)=9∶1的流動相組合拆分戊唑醇,分離度也可達到1.85.值得一提的是,甲醇適合于拆分烯效唑,但卻無法拆開戊唑醇.而異丙醇正好相反.

三唑酮的兩個對映體在固定相上的保留能力非常接近,將乙醇和異丙醇作為改性劑時,對映體分離度幾乎為0.最后,采用5%的甲醇基本實現了其兩個對映體的分離,分離度為1.06.

在HPLC上,惡醚唑的兩組對映體在Chiralcel OD上始終無法得到有效分離[11],周穎等在Chiralcel OJ柱上,使用V(正己烷)∶V(乙醇)=9∶1的流動相分離了該農藥的四個對映體[12].我們使用SFC,在Chiralpak IB柱上考察了三種醇類改性劑的拆分效果,三種改性劑都能拆開惡醚唑的第一組對映體,但只有乙醇才能拆開其第二組對映體.在3%到18%的改性劑比例區間內,我們考察了乙醇對手性分離的影響,發現了一個重要的現象:隨著乙醇濃度的升高,第二組對映體的分離度先增加后減小,在乙醇濃度為10%時分離度達到最大值.V(CO2)∶V(乙醇)=9∶1的流動相組合即為惡醚唑的最佳拆分條件.

2.2 手性拆分機理的探討

手性化合物在手性固定相上的拆分機理尚未被徹底闡明,對映體與手性固定相間存在著偶極-偶極、氫鍵-氫鍵、π-π作用和非手性作用(空間位阻作用)等作用力[13].對映異構體與固定相發生作用時彼此會有差異,正是這由于三唑類農藥與手性固定相之間的作用非常復雜,我們在這里僅僅對其手性識別作用的可能性進行初步探討.首先,三唑酮分子中的羰基(C=O)可以和手性固定相中的羰基(C=O)形成偶極-偶極作用,也可與固定相中的NH基團形成氫鍵作用.己唑醇、戊唑醇、烯效唑分子中的羥基(OH)也能與固定相中的羰基(C=O)形成氫鍵作用.6種農藥中的苯環都能與固定相中的芳香環形成π-π共軛作用.農藥苯環上的氯原子具有很強的負電性,很可能會影響發生在固定相(NH基團)上的氫鍵作用.在農藥分子在與固定相發生化學鍵作用的同時,也可能受到固定相手性空腔的影響.

3 結 論

使用 SFC,以SC-CO2為流動相,以甲醇、乙醇或異丙醇為流動相改性劑,實驗研究了6種唑類殺菌劑的手性分離.除了惡醚唑外,其他5種農藥的手性對映體都獲得了有效拆分;流動相改性劑的加入比例和種類都會對拆分結果產生影響;乙醇適合于拆分己唑醇、惡醚唑,甲醇適合拆分戊唑醇、三唑酮、腈菌唑,異丙醇則適合于分離烯效唑.通過實驗和比較分析,最終得到了最佳拆分條件.

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