結核/非結核分枝桿菌核酸快速檢測方法臨床應用價值

康麗軍 洪峰 馮建兵 劉威 吳華 易俊莉 王甦民

(1.北京老年醫院 北京 100095;2.北京結核病控制研究所 北京 100035;3.北京洛奇臨床檢驗所 北京 102206)

結核/非結核分枝桿菌核酸快速檢測方法臨床應用價值

康麗軍1洪峰2馮建兵3劉威1吳華1易俊莉2王甦民2

(1.北京老年醫院 北京 100095;2.北京結核病控制研究所 北京 100035;3.北京洛奇臨床檢驗所 北京 102206)

目的評價結核/非結核分枝桿菌核酸快速檢測方法的臨床應用價值>。方法應用實時熒光PCR技術對420例標本進行臨床試驗研究,并與抗酸桿菌涂片和分枝桿菌培養方法對照比較>。結果結核分枝桿菌核酸檢測靈敏度為48.5%(其中菌陽標本靈敏度為95.8%,菌陰標本靈敏度為14.5%),特異度99.3%,陽性預測值為99.1%,陰性預測值為55.5%;臨床試驗388例痰標本中檢測出1例非結核分枝桿菌核酸陽性,經測序確認,準確率100%;同時對32例非結核分枝桿菌臨床分離株進行核酸檢測,并經測序確認,準確率100%>。結論應用實時熒光PCR技術,能實現在1支管內同時進行結核分枝桿菌/非結核分枝桿菌的核酸檢測。該方法具有簡單快速、特異性好污染性少的特點。可作為實驗室輔助檢測結核/非結核分枝桿菌核酸方法之一。

分枝桿菌,結核;分枝桿菌屬;核酸類;聚合酶鏈反應

結核病是由結核分枝桿菌復合群引起的疾病;而非結核分枝桿菌則引起NTM病。由于結核病和NTM病兩者在發病、臨床表現、影像學、涂片和培養、結核菌素試驗、病理學檢查等方面均十分相似,臨床上很難進行區分診斷,只能從標本中分離出分枝桿菌,作菌種鑒定,才能確診。而菌種鑒定往往需要1～2個月的時間,由于兩種病的治療方案不同,這樣會延誤對病人的診斷和治療,同時也造成不必要的經濟損失。隨著分子生物學技術的引進,一些快速、簡單準確的方法已應用于實驗室,如常用的HPLC是通過分析分枝桿菌細胞壁的特異性成分結核菌脂酸(mycolic acid)和β-羥基-α脂肪酸的不同鑒定分枝桿菌,核酸的直接測序方法等國內外都有相關報道,并使分枝桿菌感染流行病方面長期存在的問題迎刃而解,但未見在1支管內同時能夠檢測結核/非結核分枝桿菌核酸的方法。我們采用實時熒光PCR[1-3]技術對本院收集的臨床標本,在每1支管內同時檢測結核/非結核分枝桿菌核酸,并對其應用價值進行評價。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 標本來源 收集2009—2010年臨床標本420例(包括32株PNB陽性臨床分離株)。肺結核組：按中華醫學會結核病學分會《肺結核診斷和治療指南》規定[4]收集臨床已確診的結核病人痰標本235例,其中痰菌陽性樣本97例,痰菌陰性病例138例。非結核肺部疾患病人痰標本103例(支氣管肺炎51例,肺癌病人29例,肺膿瘍7例,細菌性肺炎9例,間質性肺炎7例)。健康志愿者咽拭子標本50例。男性263例,女性157例,平均年齡52.9歲(最大96歲,最小14歲)。

1.1.2 標準菌株及臨床分離株來源 結核分枝桿菌H37Rv,迪氏分枝桿菌,南非分枝桿菌,鳥分枝桿菌,胞內分枝桿菌,蟾蜍分枝桿菌,土地分枝桿菌,堪薩斯分枝桿菌,不產色分枝桿菌,施氏分枝桿菌,偶然分枝桿菌,愛知分枝桿菌,杜氏分枝桿菌,加地斯分枝桿菌,利英斯分枝桿菌,奧布分枝桿菌,副偶然分枝桿菌,羅德島分枝桿菌,瘰疬分枝桿菌,恥垢分枝桿菌,海分枝桿菌,龜分枝桿菌,龜分枝桿菌膿腫亞種,草分枝桿菌各一株均來自于中國藥品檢定所。32株對硝基苯甲酸培養基(PNB)陽性非結核分枝桿菌臨床分離株收集于本院與北京結核病控制研究所。

1.1.3 儀器 ABI 7700熒光PCR分析儀

1.1.4 試劑 博奧生物有限公司研究開發的結核/非結核分枝桿菌核酸檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)用于臨床標本結核/非結核分枝桿菌核酸檢測。批號：20080201

1.2 方法

1.2.1 痰、咽拭子抗酸桿菌染色涂片、培養及分枝桿菌菌種鑒定對硝基苯甲酸(PNB)生長試驗：均嚴格按《結核病診斷實驗室檢驗規程》操作。

1.2.2 實時熒光PCR方法 采用博奧生物有限公司研究開發的結核/非結核分枝桿菌核酸檢測試劑盒,對臨床采集標本進行抗酸、提取及PCR擴增。

1.2.2.1 核酸提取[5]按照參考文獻[5]方法進行,并略做修改。簡述如下：痰液及咽拭子中加入等量的4%NaOH溶液,震蕩混勻。取1 ml液化后標本充分渦旋后12 000轉/min離心5 min,棄上清。加入1 ml洗液,充分渦旋后 12 000轉/min離心5 min,棄上清。加入50 μ l核酸提取液,充分渦旋轉入核酸提取管中,放入核酸提取儀,最大轉速振蕩5 min。95℃水浴鍋中放置5 min,瞬時離心,放置-20℃保存備用。

1.2.2.2 PCR擴增 取出擴增反應液,置于冰盒上,解凍,每個標本取核酸 2 μ l(吸取核酸盡量吸取上層液體),加入擴增反應液管中。然后進行PCR擴增：37℃300 s 1個循環;94℃180 s 1個循環;94℃15 s 40個循環;60℃30 s 40個循環;50℃10 s 1個循環。在檢測時,同時選擇FAM和HEX(或VIC)通道,采集熒光點選擇在60℃30 s。每次檢測均設陰性和陽性對照。陰、陽對照品加入量均為 2 μ l。

1.2.3 結果的分析判定 確定陽性和陰性對照品是否擴增正常。

正常陰性對照品：無S型擴增曲線,且Ct應為40或無任何數值。

正常陽性對照品：擴增呈S型曲線,且Ct應小于40。

以上2個條件應同時滿足,否則,此次實驗視為無效。

樣品擴增呈S型曲線,且Ct值小于40的報告陽性,否則為陰性。

結果解釋見表1。

1.2.4 DNA序列測定 對檢測為非結核分枝桿菌(NTM)的樣品核酸進行DNA序列測定,以驗證熒光PCR檢測結果。對擴增得到的PCR產物通過標準的Sanger DNA測序方法進行直接DNA序列測定(北京邁奧德恩生物科技有限公司)。

表1 結核/非結核分枝桿菌核酸(PCR-熒光探針法)檢測結果解釋

表2 M TB/N TM 細菌學(表型)與核酸檢測結果(實時熒光PCR方法)

表 3 NTM 細菌學(表型)與核酸檢測結果(實時熒光 PCR方法)

2 結果

2.1 本次試驗共收集臨床標本420例。以細菌學結果為對照,應用PCR-熒光探針法檢測388例痰、咽拭子和32例臨床分離株標本中結核/非結核分枝桿菌核酸。結核分枝桿菌核酸靈敏度為48.5%(其中菌陽標本靈敏度為95.9%,菌陰標本靈敏度為14.5%)特異性99.3%(其他肺部疾患和健康組共153例,核酸陽性1例)。陽性預測值為99%,陰性預測值為55.4%。在388例PNB陰性痰和咽拭子標本中;377例為NTM核酸陰性,特異性99.7%。1例NTM核酸陽性,敏感度100%。同時對32份PNB陽性臨床分離株和23份(只做對照不統計在表內)非結核分枝桿菌標準菌株進行核酸檢測,55份標本NTM均為陽性。敏感度為100%,并經測序加以確認,檢測結果請見表2、3。

2.2 重復性 選取本次試驗標本中46例,再次進行結核/非結核分枝桿菌核酸檢測。符合率100.0%。

3 討論

多年來,由于中國結核病的控制項目的實施和所取得的經驗,進一步完善了現代結核病控制的策略和方法,但由于 HIV/AIDS的流行逐漸增加,NTM病的發病率迅速上升,美國研究表明HIV陽性者是感染NTM病的高危人群[6]。NTM病主要損害肺部,具有與結核病臨床表現相似的全身中毒癥狀和局部損害表現,在無菌種鑒定結果的情況下,可能誤診為結核病,多數NTM對抗結核藥物耐藥。用抗結核藥物治療療效不佳,并且藥物會對患者的肝及神經系統有所損害,由于NTM病人和M TB病人在治療上存在著差異。所以確定NTM感染病人在臨床上有重要意義。傳統方法鑒別MTB和NTM方法主要以細菌學為主,傳統的PNB培養法是依據PNB在一定的濃度[7](含PNB500 mg/ml培基)下選擇抑制結核分枝桿菌復合群的生長而不抑制非結核分枝桿菌生長原理,作為實驗室常規檢測項目,該方法由于周期長操作繁瑣,不能及時為臨床醫生提供診斷依據,有其局限性。本研究采用博奧公司開發生產的《結核/非結核分枝桿菌熒光PCR試劑盒》對420例臨床標本進行了核酸檢測,該方法利用結核分枝桿菌和分枝桿菌特異性的核酸序列,采用雙重實時熒光PCR技術和TaqMan探針技術實現對分枝桿菌的檢測。分別針對結核分枝桿菌和分枝桿菌的特異性序列設計引物和探針,2個探針分別標記不同的熒光物質。當反應體系中有目的基因存在時,隨著PCR反應的進行,就會釋放出熒光。通過檢測不同通道的熒光信號,來檢測結果,從而實現在一管中同時檢測結核和非結核分枝桿菌。

臨床上診斷菌陰肺結核是長期存在的難點。根據中華醫學會結核病學分會《肺結核診斷和治療指南》中菌陰肺結核診斷標準,其中之一是指經痰涂片法和/或培養法進行分枝桿菌檢查為陰性的活動性肺結核。對于結核病人標本,其結核分枝桿菌的檢出結果受多種因素限制：包括病理狀況,例如結核病變性質、病變嚴重程度、病變是封閉或開放的、病變排出的菌量及排出的間歇時間;結核分枝桿菌狀態,例如代謝及繁殖是否旺盛、是否處于休眠狀態,細菌形態多樣性等因素。菌陰肺結核占全部肺結核的40%～60%。菌陰肺結核病人如果不給予治療,近一半的病人將發展為涂陽,成為新的傳染源[8]。本研究的熒光PCR方法是檢測樣本中的分枝桿菌核酸,如果病變處排菌量少或處于排菌間歇時間,則無法檢測到樣本中的分枝桿菌核酸。本方法的菌陰結核靈敏度(14.5%)低于其他作者報道的熒光PCR的靈敏度(約40%)[9],分析原因是本次試驗選取的菌陰標本大多是臨床診斷為穩定期的病人,痰標本連續三次以上取樣均為涂陰培陰結果。在痰菌陰性標本中,可能標本量少的原因,PNB為陰性檢出1例NTM陽性,經追蹤檢查為外地來京治療非結核分枝桿菌感染病人。當地醫院誤診誤治了一段時間。所以對于菌陰結核的檢測,需聯合其他方法和臨床診斷結果來確定。

長期以來,由于非結核分枝桿菌受到檢查和鑒定菌種方法等因素的限制,分枝桿菌屬的分類鑒定一直采用以表型特征為主的方法,隨著分子生物學的發展,聚合酶聯反應(PCR)PCR-限制性片段長度多態性分析,PCR-核酸雜交以及直接核酸測序技術為分枝桿菌的分類、鑒定開辟了新途徑。本實驗應用雙重實時熒光PCR和 TaqMan探針技術,通過420例臨床標本的分枝桿菌核酸檢測,可以實現幾個小時,在1支管內同時完成MTB/NTM分枝桿菌核酸檢測。該方法特異性好,污染性少,為臨床實驗室分枝桿菌常規檢測、流行病學NTM調查及分布狀況提供一個快速準確的輔助檢測方法。

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Clinical value of real-time FQ-PCR assay for detection of Mycobacterium tuberculosis/non-tuberculous mycobacteria

Kang Lijun,Hong Feng,Feng Jianbing,Liu Wei,Wu Hua,Y i Junli,Yi Junli,Wang Sumin
1.Beijing Old Hospital,Beijing100095,China;
2.Beijing Research Institute for Tuberculosis Control,Beijing100035,China;
3.Beijing Lawke HeaHh laboratory,Beijing102206,China

ObjectiveTo evaluate the clinical diagnostic value of real-time FQ-PCR assay for the detection ofMycobacterium tuberculosis(MTB)/non-tuberculous mycobacteria(NTM).Methods420 specimens were detected by real-time FQ-PCR,and the results were compared with those of AFB smear and culture.ResultsThe sensitivity of FQ-PCR was 48.5%,in which the sensitivity in bacterium-positive and bacterium-negative specimens were 95.8%and 14.5%,respectively.The specificity,positive predictive value and negative predictive value of FQ-PCR were 99.3%,99.1%and 55.5%,respectively.1 of 388 sputum specimens was NTM-positive by FQ-PCR,which was confirmed by DNA sequencing.32 NTM isolates were confirmed by FQ-PCR and DNA sequencing.Their accuracy was 100%.ConclusionsThe real-time FQ-PCR was a simple,rapid and specific assay for the detection ofMycobacterium tuberculosis/non-tuberculous mycobacteria in a sealed tube.

Mycobacterium tuberculosis;mycobacterum;nucleic acids;polymerase chain reaction

Hong Feng(hongfeng@bjhb.gov.cn)

洪峰(hongfeng@bjhb.gov.cn)

2011-03-05)

(本文編輯：張曉進)