采用FTIR法研究酸模葉蓼對錳脅迫生理響應的影響

薛生國，黃艷紅，王鈞，田守祥，雷杰，何哲祥

(中南大學 冶金科學與工程學院，湖南 長沙，410083)

礦業廢棄地物理結構不良、養分缺乏、重金屬毒性大等，一般植物難以生長[1]。植物穩定技術利用耐性植物降低重金屬的生物有效性，是一種比較有應用前景的環境友好技術[2-3]。Baker[4]認為植物對重金屬耐性的獲得可通過2種途徑：一是排斥性，即重金屬被植物吸收后通過主動運輸或老化器官脫落排出體外，或者重金屬在植物體內的運輸受到阻礙；另一途徑是積累性，即重金屬在植物體內以不具生物活性的解毒形式存在，如細胞壁的錳沉淀作用阻止過多的錳進入原生質，進入原生質的錳還可以通過向液泡中輸送而減少原生質中的濃度，以有機酸，蛋白質類物質與錳反應形成沉淀和螯合物降低自由態的錳濃度。傅里葉紅外光譜(Fourier transform infrared spectrometry，FTIR)是一種基于化合物中官能團和極性鍵振動的結構分析技術，其作為一種分析生物高分子聚合物的方法，已廣泛應用于大分子化合物結構分析以及蛋白質的二級結構解析，是獲取分子結構信息的有力工具，而且只要各種化學成分的含量相對穩定，樣品的處理方法按統一要求進行，其紅外光譜是相對穩定的[5]。研究表明：酸模葉蓼(Polygonum lapathifolium)在 5.0 mmol·L-1和 10.0 mmol·L-1錳處理條件下，葉錳含量分別達18.71和27.66 g/kg(干重)生長正常，并未出現錳毒癥狀，是一種潛在的錳超積累植物，因此，探討不同錳處理條件下其植物化學組成上的差異將有利于揭示其耐錳機制。目前，國內外對錳耐性植物不同組織器官化學組分進行FTIR的研究較少[6]，對酸模葉蓼的相關研究尚未見報道，為此，本文作者利用 FTIR對酸模葉蓼根、莖和葉的化學組分進行研究，以便為重金屬污染環境修復提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗方法

酸模葉蓼種子播種于裝有洗凈細砂的花盆中育苗。待幼苗萌發2周后，依次在0.25 Hoagland營養液和0.50 Hoagland營養液預培養15 d，選取生長一致的酸模葉蓼幼苗，將根部用去離子水洗凈，移至外壁不透光的塑料容器。設定6種錳濃度分別為0.005，0.2，0.5，2.0，5.0 和 10.0 mmol·L-1。錳以 MnCl2的形式加入，每個處理進行重復3次實驗。每4 d換1次營養液，每天用0.1 mol/L NaOH或0.1 mol/L HCl調pH至5.5左右，保持連續通氣。植物在35 d后收獲，用去離子水洗凈，分別取根、莖、葉3部分于105 ℃殺青30 min,然后于75 ℃烘箱中干燥48 h，用萬能粉碎機粉碎，過75 μm篩。

1.2 傅里葉紅外光譜分析

應用FRIR儀(美國Nicolet公司Nexus 670,光譜范圍為4 000～500 cm-1，分辨率為4 cm-1，掃描累加次數32次)測定酸模葉蓼各組織器官光譜信息。

1.3 數據分析

實驗數據采用Microsoft Excel 2003進行分析，并采用Origin(8.0)對紅外光譜數據圖譜進行處理。

2 結果與分析

2.1 根的FTIR分析

圖 1所示為不同錳濃度酸模葉蓼根的紅外光譜圖，圖2為其特征峰變化圖。從圖1可見：在3 420 cm-1附近的峰是分子間氫鍵 O—H自由羥基的伸縮振動峰，主要來自于纖維素、半纖維素、多糖等碳水化合物[7]；隨著錳處理濃度的升高，吸收峰移向低頻3 390 cm-1，同時峰形變窄。從圖2可以看出：隨著錳處理濃度的升高(0.005～2.0 mmol·L-1)，吸光度上下波動，但峰值總體變化不大，說明低外源錳處理對纖維素、半纖維素、多糖等碳水化合物的合成和運輸影響不大；當錳濃度為2.0～5.0 mmol·L-1時，峰值隨著外源錳處理濃度的升高而下降，根外表皮細胞壁的羥基吸附結合Mn2+形成穩定的化合物，使細胞表面的氫鍵減少；當錳濃度大于5.0 mmol·L-1時，峰值又呈上升態勢，說明高外源處理濃度的錳可能破壞了根外表皮細胞壁的羥基吸附結合Mn2+的機制，導致根外表皮細胞壁的羥基無法結合Mn2+，引起峰值升高。

圖1 不同錳濃度下酸模葉蓼根系的傅里葉紅外光譜圖Fig.1 Absorption FTIR spectra of roots of P. lapathifolium in different manganese concentrations

圖2 不同錳濃度下酸模葉蓼根系的特征峰變化圖Fig.2 Band height changes in roots of P. lapathifolium in different manganese concentrations

2 920 cm-1附近的吸收峰是飽和C—H 鍵的伸縮振動, 主要來自于細胞壁中蛋白質、纖維素和果膠等組織成分(圖 1)；隨著錳濃度的升高(0.005～0.5 mmol·L-1)，吸光度未發生明顯變化，表明低錳脅迫對細胞壁中的蛋白質、纖維素和果膠質等組織成分的分泌和運輸影響不大；當錳濃度為0.5～5.0 mmol·L-1時，吸光度先上升后下降(圖2)，說明隨著錳濃度的升高，酸模葉蓼的根部細胞不斷分泌有機酸，螯合錳的有機酸消耗速率和根部的有機酸分泌速率相互作用，導致羧酸頻帶先上升后下降；當錳濃度大于5.0 mmol·L-1時，羧酸螯合力變弱，錳毒害進一步加重，頻帶略微上升。

1 060 cm-1附近的吸收峰為碳水化合物(醇、醚基、酯基或酚)的C—O基團的伸縮振動[8](圖1)。隨著錳濃度的升高(0.005～0.5 mmol·L-1)，吸光度變化不大，但在錳濃度為2.0 mmol·L-1時，出現顯著吸收峰，峰值達到最大，當錳濃度大于2.0 mmol·L-1時，峰值下降；當錳濃度在0.5～2.0 mmol·L-1時，膜過氧化機制對峰值變化起主導作用，隨著錳濃度的升高，膜過氧化程度加深，脂肪族酮類化合物過氧化產物在根部積累，引起峰值升高。而在錳濃度大于2.0 mmol·L-1后，高外源處理濃度的錳可能破壞了膜過氧化機制，造成脂肪族酮類化合物過氧化產物減少，引起峰值下降[9-11]。

2.2 莖的FTIR分析

圖3 不同錳濃度下酸模葉蓼莖的傅里葉紅外光譜圖Fig.3 Absorption FTIR spectra of stems of P. lapathifolium in different manganese concentrations

圖4 不同錳濃度下酸模葉蓼莖的特征峰變化圖Fig.4 Band height changes in stems of P. lapathifolium in different manganese concentrations

圖3 所示為不同錳濃度下酸模葉蓼莖的紅外光譜圖，圖4所示為不同錳濃度下酸模葉蓼莖的特征峰變化圖。從圖4可見：隨著生長介質錳濃度的升高，吸光度先下降后上升。這表明在外源錳的脅迫作用下(0.005～0.5 mmol·L-1)，莖細胞的細胞壁羥基吸附結合Mn2+，使細胞表面的氫鍵減少，引起峰值下降；而當生長介質錳濃度為0.5～10.0 mmol·L-1時，隨著錳處理濃度的升高，該峰的吸光度上升。這說明高外源處理濃度的錳促進了纖維素、半纖維素、多糖等有機物的分泌和運輸，酸模葉蓼則通過滲透作用來增強莖對外源錳的抗逆性。

2 920 cm-1附近的振動吸收帶，主要來自于碳水化合物、維生素和各種膜及細胞壁的組織等成分，這與莖的運輸功能有關。從圖3可以看出：該處峰形未發生明顯位移，肩峰變化不大。隨著錳濃度的升高(0.005～0.5 mmol·L-1)，吸光度變化不大，當錳濃度大于0.5 mmol·L-1時，吸光度輕微升高與下降(圖4)。這表明錳濃度小于0.5 mmol·L-1時，低錳處理對酸模葉蓼莖的運輸功能影響不大。在錳濃度大于 2.0 mmol·L-1時，促進酸模葉蓼產生碳水化合物等物質增強其錳耐性，但當錳濃度大于5.0 mmol·L-1時，高外源處理濃度的 Mn2+已經影響了細胞中碳水化合物等的合成和運輸。

1650～1620 cm-1處為締合態伯酰胺面內彎曲振動(δ N-H)的吸收帶。從圖4可見：隨著錳濃度的升高(0.005～0.2 mmol·L-1)，吸光度下降，說明蛋白二級結構中，肽鍵間氫鍵的結合力變弱；當錳濃度大于 0.2 mmol·L-1時，吸光度上升，可能是由于不斷增加的外源錳誘導富脯氨酸蛋白、病害相關蛋白和富甘氨酸蛋白等蛋白的合成，這些重金屬脅迫誘導蛋白可能具有保護植物細胞免受重金屬毒害的作用[9]，而錳濃度大于0.2 mmol·L-1時出現的吸收峰上升可能與酸模葉蓼葉中氨基酸、多肽和蛋白質類物質含量升高有關；當錳濃度大于2.0 mmol·L-1時，吸光度下降，說明蛋白二級結構中肽鍵間氫鍵的結合力受影響較大。

從圖3看出：隨著錳濃度的升高，其最大吸收帶由對照的1 060 cm-1移到1 052 cm-1附近，但峰形變化不大，肩峰變化不明顯；隨著錳濃度的升高(0.005～0.5 mmol·L-1)，吸光度變化不大。在錳濃度為2.0 mmol·L-1時，出現顯著吸收峰，峰值達到最大；而當錳濃度大于2.0 mmol·L-1時，吸光度下降。說明錳濃度為0.5～2.0 mmol·L-1時，膜過氧化機制對峰值變化起主導作用，隨著錳濃度的升高，膜過氧化程度加深，脂肪族酮類化合物過氧化產物在根部積累，引起峰值升高。當錳濃度大于5.0 mmol·L-1時，高濃度的Mn2+可能破壞了此機制，造成脂肪族酮類化合物過氧化產物減少，引起峰值下降。

2.3 葉的FTIR分析

圖5為不同錳濃度下酸模葉蓼葉的傅里葉紅外光譜圖，圖6為其特征峰變化圖。3 420 cm-1附近的吸收峰反映葉片中碳水化合物(纖維素、半纖維素、多糖)、脂肪酸、蛋白質和核酸等對光譜的貢獻(圖 5)。由圖 6可以看出：隨著錳濃度的升高(0.005～0.5 mmol·L-1)，吸光度無明顯變化，說明低錳脅迫對酸模葉蓼葉片中碳水化合物等有機物的運輸和合成沒有明顯影響，表現出酸模葉蓼對外源錳的耐性特征；當錳濃度大于0.5 mmol·L-1時，該峰的吸光度先下降后上升。說明隨著錳濃度的持續升高，酸模葉蓼葉片的生理過程開始受到影響；當錳濃度大于0.5 mmol·L-1時，吸光度下降，這是因為葉片表皮細胞壁的羥基吸附結合錳，使細胞表面的氫鍵減少；當錳濃度大于 2.0 mmol·L-1時，吸光度上升。這說明隨著錳濃度的升高促進了碳水化合物等有機物的分泌和運輸，通過滲透作用來增強葉對錳的抗逆性。

2 920 cm-1處的吸收峰主要來自于維生素和各種膜及細胞壁的組織成分等，這與酸模葉蓼的運輸功能有關(圖 5)。該處肩峰變化不大，隨著錳濃度的升高(0.005～0.5 mmol·L-1)，吸光度變化不大。當錳濃度大于0.5 mmol·L-1時，吸光度先下降后升高。說明低濃度的Mn2+對酸模葉蓼中羧酸等物質運輸影響不大，但在錳濃度大于0.5 mmol·L-1時，吸光度下降，是因為葉部中有機酸不斷螯合Mn2+，降低Mn2+對葉的毒害。當錳濃度大于2.0 mmol·L-1時，吸光度的上升，則說明隨著錳供應水平的不斷升高，促進了碳水化合物等有機物的分泌和運輸，通過滲透作用來增強葉對錳的抗逆性。

從圖 6可見：隨著錳濃度的升高(0.005～0.5 mmol·L-1)，1 650～1 620 cm-1處的吸收峰變化不大。說明蛋白二級結構中肽鍵間氫鍵的結合力受影響較小；當錳濃度大于2.0 mmol·L-1時，吸光度下降。說明隨著錳濃度的升高，蛋白二級結構中，肽鍵間氫鍵的結合力變弱；當錳濃度大于2.0 mmol·L-1時，吸光度上升，可能是由于不斷增加的外源錳誘導富脯氨酸蛋白、病害相關蛋白和富甘氨酸蛋白等一些蛋白的合成，Didierjean等[12]認為這些重金屬脅迫誘導蛋白可能具有保護植物細胞免受重金屬毒害的作用；而濃度大于2.0 mmol·L-1時出現的吸收峰上升可能與酸模葉蓼葉中氨基酸、多肽和蛋白質類物質含量升高有關。

圖5 不同錳濃度下酸模葉蓼葉的傅里葉紅外光譜圖Fig.5 Absorption FTIR spectra of stems of P. lapathifolium in different manganese concentrations

圖6 不同錳濃度下酸模葉蓼莖的特征峰變化圖Fig.6 Band height changes in leaves of P. lapathifolium in different manganese concentrations

隨 著錳 濃 度的 升高(0.005～0.500 mmol·L-1)，1 060cm-1附近吸收峰值(圖5)無明顯變化。說明低濃度的Mn2+對該類物質的運輸影響不大。當錳濃度大于0.5 mmol·L-1時，吸光度出現略微下降。說明當錳濃度大于0.5 mmol·L-1時，外源Mn2+已影響了酸模葉蓼中碳水化合物的運輸。當錳濃度大于2.0 mmol·L-1時，吸光度上升，可能是膜過氧化程度加深，脂肪族酮類化合物過氧化產物在葉部積累，引起峰值升高。

3 結論

(1) 糖類和氨基酸等有機化合物在低錳濃度處理下往往作為滲透性調節物質出現，含量升高，其耐錳性增強，但隨著錳濃度的升高，其合成和運輸受限，含量逐漸下降。

(2) 根和葉分別在2 920 cm-1和1 630 cm-1處表現為酸模葉蓼分泌有機酸不斷螯合錳，造成羧酸 O—H減少；隨著錳濃度的升高，其羧酸螯合力變弱；葉在1 630 cm-1處的顯著吸收峰可能與酸模葉蓼葉中氨基酸、多肽和蛋白質類物質含量升高有關。

(3) 酸模葉蓼根、莖、葉在1 060 cm-1處在最高錳濃度下吸光度特征峰值的變化，主要表現是膜脂過氧化，這可能與酸模葉蓼的錳耐性有關。

[1] Wong M H. Ecological restoration of mine degraded soils, with emphasis on metal contaminated soils[J]. Chemosphere, 2003,50(6): 775-780.

[2] Teng Y, Luo Y M, Huang C Y, et al. Tolerance of grasses to heavy metals and microbial functional diversity in soils contaminated with copper mine tailings[J]. Pedosphere, 2008,18(3): 363-370.

[3] Conesa H M, Faz A, Raquel Arnaldos. Initial studies for the phytostabilization of a mine tailing from the cartagenalaunion mining district (SE Spain)[J]. Chemosphere, 2007, 66(1): 38-44.

[4] Baker A J M. Metal tolerance[J]. New Phytologist, 1987,106(suppl.): 93-111.

[5] Bosch A, Serra D, Prieto C, et al. Characterization of Bordetella pertussis growing as biofilm by chemical analysis and FT-IR spectroscopy[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2006,71(5): 736-747.

[6] 龔寧, 李榮華, 孟昭福, 等. Cd對小白菜萌發生理影響的FTIR-ATR研究[J]. 農業環境科學學報, 2010, 29(1): 9-14.GONG Nin, LI Rong-hua, MENG Zhao-fu, et al. Physiological response of Brassica chinensis L. seeds in germination to cadmium toxicity by FTIR-ATR spectroscopy[J]. Journal of Argo-Environment Science, 2010, 29(1): 9-14.

[7] 陸婉珍, 袁洪福, 徐廣通, 等. 現代近紅外光譜分析技術[M].北京: 中國石化出版社, 2000: 19-26.LU Wan-zhen, YUAN Hong-fu, XU Guang-tong, et al. NIR spectra analysis[M]. Beijing: China Petrochemical Press, 2000:19-26.

[8] 趙藻藩, 周性堯, 張悟銘, 等. 儀器分析[M]. 北京: 高等教育出版社, 1990: 87-94.ZHAO Zao-fan, ZHOU Xing-yao, ZHANG Wu-ming, et al.Instrument analysis[M]. Beijing: Higher Education Press, 1990:87-94.

[9] 遲光宇, 劉新會, 劉素紅, 等. Cu污染與小麥特征光譜相關關系研究[J]. 光譜學與光譜分析, 2006, 26(7): 1272-1276.CHI Guang-yu, LIU Xin-hui, LIU Su-hong, et al. Studies of relationships between Cu pollution and spectral characteristics of TritiZnm aestivum L[J]. Spectroscopy and Spectral Analysis,2006, 26(7): 1272-1276.

[10] 陳思寧, 劉新會, 侯娟, 等. 重金屬鋅脅迫的白菜葉片光譜響應研究[J]. 光譜學與光譜分析, 2007, 27(9): 1797-1810.CHEN Si-ning, LIU Xin-hui, HOU Juan, et al. Study on the spectrum response of Brassica campestris L leaf to the zinc pollution[J]. Spectroscopy and Spectral Analysis, 2007, 27(9):1797-1810.

[11] 張曉斌, 劉鵬, 李丹婷, 等. 鉻誘導植物根細胞壁化學成分變化的 FTIR表征[J]. 光譜學與光譜分析, 2008, 28(5):1067-1070.ZHANG Xiao-bin, LIU Peng, LI Dan-ting, et al. FTIR spectroscopic characterization of chromium-induced changes in root cell wall of plants[J]. Spectroscopy and Spectral Analysis,2008, 28(5): 1067-1070.

[12] Didierjean L, Frendo P, Nasser W, et al. Heavy metal responsive genes in maize: identification and comparison of their expression upon various forms of abiotic stress[J]. Planta, 1996,199(1): 1-8.