PCR-DGGE法研究Sludge bio-membrane(SB)系統中反硝化聚磷菌的變化

劉暉，孫彥富，周康群，顧雪婷，劉潔萍，陳捷美

(仲愷農業工程學院 環境科學與工程系，廣東 廣州，510225)

控制并降低污水中的氮、磷濃度是防止水體富營養化的主要措施，因此，生物同步脫氮除磷技術是目前國內外污水處理研究領域的重點和熱點。在污水處理廠的實際運行過程中發現有一類反硝化聚磷菌(即DPB)，其在厭氧條件下吸收有機物同時合成為細胞內儲備營養物PHB(聚β-羥基丁酸)并釋放正磷酸鹽，而在缺氧環境下利用硝酸鹽作為電子受體，進行反硝化作用的同時超量聚磷，使除磷和脫氮這2個生物過程在缺氧環境下由同一類微生物一并完成。由此開發的工藝不僅降低了脫氮對碳源的需要，而且可節省好氧聚磷所需能源和池容，此外，剩余污泥量也大大降低[1-3]，是一種低碳節能高效的新技術。目前，國內反硝化聚磷的研究多利用 SBR反應器在實驗室采用人工模擬廢水進行研究[4-6]，但是，利用連續流的SB活性污泥與生物膜復合系統(SB系統)、采用實際的污水來進行同步反硝化聚磷的研究報道較少。國內外對菌富集過程中反硝化聚磷菌種類的變化研究很少，僅周康群等[4-6]對反硝化聚磷SBR系統中的微生物組成采用傳統的微生物方法進行了研究。迄今為止，采用PCR-DGGE技術對SB系統在富集過程中微生物種群變化的系統研究尚未見文獻報道。本研究采用SB系統富集反硝化聚磷菌，以3個處理階段的泥水混合液為研究對象，進行了微生物種群變化的跟蹤與研究。為研究SB系統中的種群多樣性及其作用微生物學機理，從運行不同時期裝置中提取污水混合液，利用平板分離法和 PCR-DGGE法同步跟蹤不同馴化富集階段反硝化聚磷菌種群的變化情況，以便為反硝化聚磷工藝富集功能菌株及機理的進一步研究提供參考，為傳統的脫氮除磷工藝的改良、新工藝的開發與應用提供幫助。

1 材料與方法

1.1 試驗反應裝置

研究采用Sludge bio-membrane(SB)系統試驗裝置見圖1。進水流量為1 m3/d，各處理單元的操作分別為：(1) 厭氧活性污泥釋磷區：水力停留時間(HRT)為3.3 h，氧化還原電位(ORP)小于-100 mV；(2) 快速沉淀區：HRT為0.32 h；(3) 生物膜區：HRT為2.2 h，ORP大于+200 mV；(4) 兼性脫氧區：HRT為0.6 h，ORP小于+50 mV；(5) 缺氧活性污泥反硝化聚磷區：HRT為2.7 h，ORP為0～-100 mV；(6) 微曝氣區：HRT為0.15 h；(7) 沉淀區：HRT為0.3 h。

1.2 供試材料

1.2.1 試驗污水

試驗污水來自廣州市某污水處理廠的實際污水,其水質情況見表1。

表1 試驗污水成分Table 1 Composition of sewage wastewater

圖1 活性污泥與生物膜復合系統Fig.1 Activated sludge and bio-membrane combined system

1.2.2 Sludge bio-membrane(SB)同步脫氮除磷系統的運行方案

取自運行良好污水處理廠A2/O厭氧段活性污泥。將種泥與表 1中的試驗污水混合(ρ(MLSS)=3.5~4.0 g/L),以生物膜區氨氧化反應后產生的硝酸鹽為電子受體富集反硝化聚磷菌。運行方案分3個階段，先分段運行后連續運行。

第1階段為膜硝化池的啟動階段。目的是對系統中的硝化菌進行富集從而將污水中的氨氮轉化為硝酸鹽氮，為后2階段富集反硝化聚磷菌提供硝酸鹽氮的電子受體。將運行良好的廣州瀝滘污水廠 A2/O工藝好氧段活性污泥與廣州某污水處理廠污水混合，ORP控制在80~100 mV，共運行3月。

第2階段為反硝化聚磷菌的富集、設備調試階段。該階段的目的是：(1) 去除常規的反硝化菌(僅有反硝化作用而無聚磷作用)；(2) 通過對厭氧釋磷池和同步反硝化吸磷池交替運行，利用接觸氧化池產生的硝酸鹽為電子受體，對反硝化聚磷菌進行選擇和富集，該段是整個試驗的關鍵。當第1階段的好氧膜硝化池中氨氮轉化為硝酸鹽氮的轉化率穩定在90%以上后，設備進入第2階段，即同時啟動厭氧釋磷區、快速沉淀區、好氧生物膜區、兼性脫氧區、缺氧反硝化聚磷菌區、微曝氣區和二次沉淀區。其過程為：好氧釋磷區(3.30 h)→快速沉淀區(0.32 h)→好氧生物膜區(2.20 h)→兼性脫氧區(0.20 h)→缺氧反硝化聚磷區(2.70 h)→微曝氣區(0.15 h)→二次沉淀區(0.34 h)方式運行，初始污泥質量濃度控制在2.0~2.5 g/L，缺氧ORP為-100~-120 mV，厭氧ORP為-150~-220 mV，共運行6月。

第3階段為體系的穩定階段。目的是：反硝化聚磷菌富集到一定量后，進一步保持體系的穩定性，裝置共運行40 d。

當第3階段運行到39 d時，出水TP質量濃度為0.65 mg/L(＜1.00 mg/L)，總氮質量濃度為 12.6 mg/L(＜15.0 mg/L)，氨氮質量濃度為3.8 mg/L(＜5.0 mg/L)，COD質量濃度為34 mg/L(＜50 mg/L)，均低于GB18918—2002標準的要求。系統出水TP、總氮、氨氮、COD濃度變化幅度都較小，由此進一步說明體系進入穩定運行。

本試驗采用第2階段開始和第3階段末期反硝化聚磷區的污泥(此時硝酸鹽去除率高達 90.26%，磷酸鹽的去除率高達 92.31%)為研究種泥，將其分離純化后的純菌株作為研究對象。

1.2.3 聚磷菌培養液

無水乙酸鈉 5.0 g，KH2PO40.025 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，CaCl2·H2O 0.2 g，(NH4)2SO42.0 g，微量元素 1.0 mL，蒸餾水1 000 mL，pH=7.0。

1.3 試驗方法

1.3.1 反硝化聚磷菌株的分離

將 1.2.2中的研究種泥接種于牛肉浸膏蛋白胨培養基，將最佳稀釋度平板上單一菌落經過平板劃線純化得單菌株，用甘油混勻密封冷藏。

1.3.2 同步反硝化聚磷菌株顯微形態觀察、生理生化指標

將幼齡菌落進行革蘭氏染色，在100×10倍光學顯微鏡下觀察顏色和形態。進行產氨試驗、硝酸鹽還原、亞硝酸鹽還原、反硝化、異染粒、PHB染色等主要生化特性[7]試驗。

1.3.3 DNA提取、PCR擴增、基因序列比對及進化樹構建

對獲得的培養物進行離心收集沉淀，用 TE緩沖液(pH=8.0)洗滌，通過溶菌酶裂解和凍融步驟裂解細胞，以 SDS和酚/氯仿提取基因組 DNA。16S rRNA基因擴增采用寡聚核苷酸引物27 f和1522 r。PCR擴增程序：于94 ℃預變性4 min，于94 ℃變性1 min，于55 ℃復性1 min，于72 ℃延伸2 min，30次循環，最后于72 ℃延伸7 min。擴增產物送上海英駿生物技術有限公司測序。所得 16S rDNA基因序列，在GenBank數據庫中進行 BLAST序列的相關性搜索[8-9]。同時，利用相關種屬的16S rDNA序列，構建系統發育樹。序列對排用CLUSTAL X1.83 進行多序列匹配排列，進化樹的構建用Neighbour-joining方法。進化樹分枝模式的穩定性用MEGA 4.0進行bootstrap分析，重復1 000次，計算各分支的支持度。

1.3.4 PCR-DGGE的試驗過程

(1) 樣品 DNA的制備。采用修改后的 Bead-Beating法[10]，樣品中加入20 mL抽提緩沖液(0.1 mol/L Tris·Cl，0.1 mol/L EDTA-Na2，0.2 mol/L NaCl，1%PVP，2% CTAB，pH=8.0)，浸泡 30 min，超聲波 15 min，加入10 mg/mL的溶菌酶，于37 ℃振蕩45 min。加入1.5 mL 20%SDS，65 ℃水浴1 h。離心后收集上清。上清用酚、氯仿、異戊醇(體積比為25:24:1)抽提3次，并加入終濃度為0.3 mol/L的NaAc(pH=5.2)及0.6倍NaAc溶液體積的異丙醇，于室溫沉淀1 h。轉速為13 000 r/min，離心20 min，收集沉淀，并用70%乙醇漂洗2次，晾干后溶于50 μL TE中。采用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

(2) 16S rDNA-V3區擴增。將樣品分別稀釋50倍后進行 16SrDNA-V3區擴增。引物對為 F357(含 GC夾子)：5’CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCG-GGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG3’，R518：5’ATTACCGCGGCTCGCTGG 3’。25 μL 的反應體系包含 H2O 0.25 μL，10×Buffer(含 2.0 mol/L MgCl2)2.0 μL，dNTP(10 mol/L) 1.0 μL，F338(10 μmol/L)1.0 μL，R518(10 μmol/L)1.0 μL，Taq(5 U/μL) 0.1 μL和模板DNA 1.0 μL。反應程序為：于94 ℃預變性4 min；于94 ℃變性0.5 min；于52 ℃復性1 min；于72 ℃延伸0.5 min；30次循環，于72 ℃延伸7 min。反應結果用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

(3) DGGE的實驗過程。DGGE采用 BIO-RAD DGGE電泳儀。聚丙烯酰胺凝膠濃度為 8%，變性梯度為35%~65%(100%變性劑含有7 mol/L尿素和40%甲酰胺)，電泳條件為：60 ℃，180 V，電泳5 h。0.04‰的 Goldview染液 30 min后用凝膠成像系統(GDS-8000)照相。

(4) DNA的回收和PCR擴增測序。將DGGE切膠回收所得的條帶中加入適量的無菌水于 4 ℃浸泡 24 h，用作模板使用。將樣品進行16SrDNA-V3區擴增。引物對為 F338：5’ATTACCGCGGCTCGCTGG 3’，R518：5’ATTACCGCGGCTCGCTGG 3’。25 μL 的反應體系包含H2O 0.25 μL，10×Buffer(含2.0 mmol/L MgCl2)2.0 μL，dNTP(10 mmol/L)1.0 μL，F338(10μmol/L)1.0 μL，R518(10 μmol/L)1.0 μL，Taq(5 U/μL)0.1 μL和模板DNA 1.0 μL。反應程序為：于94 ℃預變性5 min；于94 ℃變性30 s；于55 ℃復性40 s；于72 ℃延伸40 s；30次循環，于72 ℃延伸7 min，測序由上海英駿生物公司進行。

2 結果與討論

2.1 利用微生物分離和純化的結果

在第2和第3階段分別分離出單菌株17株和11株。結合細菌的主要生理生化指標[7]和16S rDNA測序鑒定結果見表2。

從表2可以看出：第2階段的細菌主要為棒狀桿菌屬、不動桿菌屬、假單胞菌屬、腸桿菌科、莫拉氏菌屬、葡萄球菌屬、副球菌屬等7種，第3階段的細菌主要為組成為不動桿菌屬、假單胞菌屬、腸桿菌科、副球菌屬4種，即富集后系統內細菌種類在減少，而周康群等[4-5]在SBR反應器中分離到的反硝化聚磷菌以假單胞菌屬、棒狀桿菌屬為主，腸桿菌科和葡萄球菌屬次之。羅寧等[6]在A2/O-SBR反應器中分離到的假單胞菌屬、莫拉氏菌屬、腸桿菌科細菌、氣單胞菌屬以及不動桿菌屬與生物反硝化脫氮和生物除磷密切相關，占全部菌株的66.16%。導致結果產生差異的原因是：試驗采用Sludge bio-membrane (SB)同步脫氮除磷系統，進水水質是污水處理廠的實際污水，廢水中的碳源成分復雜；而羅寧等[6]采用實驗室自配水樣，以醋酸鈉為主要碳源；此外，運行條件不同，因此，活性污泥系統內微生物組成和數量存在一定的差異。這說明反應器中微生物種群組成和變化反映了生物脫氮除磷體系運行狀況。

表2 SB同步脫氮除磷系統不同階段中主要的細菌數量Table 2 Main bacteria of SB simultaneously nitrogen and phosphorus removal system during different stages 個

2.2 采用PCR-DGGE分析SB系統微生物的多樣性

2.2.1 DGGE圖譜分析

圖2中的樣品分別取自第2階段的開始(即反硝化聚磷菌富集前，泥樣 A)和第 3階段的末期(即富集反硝化聚磷菌，泥樣B)，從圖2可知：泥樣B的DGGE圖譜在某些位置與泥樣A的比較接近，但在某些位置存在著一些差異。在樣品A中a，b，c，d和e條帶較亮，條帶較多這說明富集前菌種豐富，不同條帶間的位置較遠而且很亮，說明菌種之間的差異比較明顯，充分顯示了裝置中微生物的多樣性。分析其原因是由于富集前種泥取自A/A/O工藝厭氧池，A/A/O工藝為一個單泥系統，具有豐富的微生物種群，主要有聚磷菌、反硝化菌等兼性厭氧菌。

圖2 DGGE圖譜Fig.2 Profile of DGGE

經過富集培養后，樣品B中的b，c和d條帶存在，而且較亮，但是，a和e條帶消失，這說明經過一段時間的富集培養，水體中占優勢的微生物種群減少了2種，微生物的多樣性呈下降趨勢。這說明富集的方式有利于反硝化聚磷菌的生長。

2.2.2 代表條帶的回收測序和進化分析

選取較有代表性的條帶a，b，c，d和e切膠回收DNA后作為模板進行PCR擴增，對產物直接測序。使用GenBank的BLAST程序將富集前后的5條序列與數據庫中已登錄的序列進行同源性比較,采用Clustal W(Versionl.8)進行多序列匹配排列，選取核酸數據庫中的序列，用Neighbour-joining方法構建進化樹，進化樹分枝模式的穩定性用 MEGA4.0軟件進行bootstrap分析，重復1 000次，計算各分支的支持度，結合伯杰氏細菌鑒定手冊和常見細菌鑒定手冊[7-10]的生理生化指標為依據鑒定歸屬。結果如下：

(1) a和Flavobacterium sp.(黃桿菌屬)的親緣關系最接近，序列同源性為95%，黃桿菌屬[11-12]是革蘭陰性桿菌，直桿狀，端圓，寬度×長度為(0.5~0.8) μm×(1.0~3.0) μm，非發酵型，在含碳水化物培養液內的反應一般不產酸也不產氣，也有兼性厭氧型，菌落呈黃色或橙色而得名。有機化能營養，接觸酶、氧化酶、磷酸酶均為陽性，細胞內不含聚β-羥基丁酸鹽，有些菌株能還原硝酸鹽和亞硝酸鹽。同時，結合反應器中硝酸鹽去除率高達90.26%，因此，a與Flavobacterium sp.(黃桿菌屬)最相似，是反硝化菌。

(2) b和Alcaligenes sp.DQ435021(產堿桿菌屬)的親緣關系最接近。通過對其基因進行比對，序列的同源性為96%。產堿桿菌屬是革蘭陰性桿菌，化能異養型，能夠利用醋酸鈉為碳源，呼吸代謝為非發酵類型，具有好氧反硝化特性。有的在硝酸鹽或亞硝酸鹽存在，能通過厭氧呼吸進行反硝化，硝酸鹽和亞硝酸鹽作為電子受體，從而產生氮氣[13]。鮑林林等[13-15]報道產堿菌屬表現出良好的反硝化吸磷效果。由此認為b與產堿桿菌屬Alcaligenes sp.最相似，是反硝化聚磷菌。

(3) c與Paracoccus sp.(副球菌屬)最相似，序列的同源性為94%。副球菌屬球形，呈單個、成對或堆存在，直徑為(0.5~0.9) μm，不運動。當硝酸鹽、亞硝酸鹽或氧化氮存在時，能以它們為電子受體進行厭氧生長，并且在厭氧條件下將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽到氧化氮和N2，因此，表現為反硝化功能。同時氧化酶和接觸酶反應呈陽性。

(4) d和Janthinobacterium sp. (紫色桿菌屬)親緣關系最為接近，序列的同源性為96%。紫色桿菌屬由于其菌落呈紫色而得名[16-17]，具有圓端的桿菌，稍彎曲，為革蘭氏陰性桿菌，無運動性，無莢膜。其生理特性為：既是氧化型又是發酵型，接觸酶陽性，吲哚陰性，磷酸酶陽性，還原硝酸鹽和亞硝酸鹽，有時產生氣體，由胨產生氨即具有反硝化功能。但尚未報道是否具有反硝化聚磷功能，由此推斷得出d與Janthinobacterium sp.(紫色桿菌屬)最相似，同時是一種反硝化菌。

(5) e為赤細菌屬(Erythrobacter sp.)，序列的同源性為97%，由于其培養物及菌落呈橘黃色或粉色而得名，是一種光合細菌,具有營養、凈化水體等作用[18]，多發現在養殖密集區和海洋中。赤桿菌屬是革蘭氏陰性桿菌，好氧，化能異養型，兼性光能異養型。可利用的碳源為：醋酸鹽、丙酮酸鹽、丁酸鹽、谷氨酸鹽及葡萄糖。生長需要維生素。最佳生長溫度為 25~30℃；pH為7.0~8.0；需要1.7%~3.5% NaCl，能將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽。由此推斷得出e與Erythrobacter sp.最相似，具有反硝化功能。

綜上所述，a應歸屬于Flavobacterium sp.(黃桿菌屬，屬Flavobacteria)，b應歸屬于Alcaligenes sp.(產堿桿菌屬 β-proteobacteria)，c應歸屬于 Paracoccus sp.(副球菌屬，屬 α-proteobacteria)，d應歸屬于Janthinobacterium sp.(紫色桿菌屬 β- proteobacteria)，e應 歸 屬 于 Erythrobacter sp.(赤 細 菌屬α-proteobacteria)。其中：b和 c為反硝化聚磷菌，a和e為反硝化菌，d是反硝化菌，但其聚磷功能有待進一步研究。

2.2.3 富集前后的群落結構差異

在樣品A中a，b，c，d和e條帶較亮，分別鑒定為黃桿菌屬、產堿桿菌屬、副球菌屬、紫色桿菌屬、赤細菌屬，其中產堿桿菌屬、副球菌屬為反硝化聚磷菌，紫色桿菌屬、黃桿菌屬、赤細菌屬為反硝化菌。這說明反硝化聚磷菌存在于A/A/O工藝的厭氧池中，只是由于A/A/O工藝的運行方式不能使其成為優勢種群，也有可能是反硝化聚磷菌在A/A/O工藝運行中體現了其好氧聚磷的特點。

B水樣中的代表條帶為3條，分別為黃桿菌屬、副球菌屬、紫色桿菌屬。從圖2可以看出：7種菌經過富集后減少為4種，這顯示SB同步脫氮除磷系統富集后微生物的多樣性有所下降。這是因為通過富集運行后，采用反硝化聚磷工藝給聚磷菌提供了厭氧缺氧交替的環境，而且控制污水中 COD質量濃度。在

厭氧釋磷后經過沉淀大大降低污水中COD質量濃度，致使缺氧池進水COD的質量濃度低于50 mg/L，消除殘余 COD對反硝化聚磷菌的影響，限制了大部分常規反硝化菌的生長，因此減少了污泥中專職的反硝化菌，從而使僅具有反硝化功能的赤細菌屬被淘汰，種群多樣性隨之降低[5]，但反硝化聚磷功能的產堿桿菌屬、副球菌屬仍然存在，充分說明系統的富集方式有利于反硝化聚磷菌的生存。但另一方面是富集后d條帶(紫色桿菌屬)很亮，反應池中硝酸鹽去除率高達90.26%，磷酸鹽的去除率高達92.31%，紫色桿菌屬的生理生化指標確定其為反硝化菌，而且從圖3所示的系統進化樹可知產堿桿菌屬、副球菌屬、紫色桿菌屬3種菌屬的親緣關系接近，而黃桿桿菌屬和赤細菌屬的親緣關系較遠，因此，紫色桿菌屬的聚磷功能有待于進一步確定。

圖3 SM系統中優勢菌群的系統進化樹Fig.3 Phylogenic tree construction of dominate bacteria in SM system

2.2.4 PCR-DGGE法與平板法的比較

從表2可以看出：富集后的細菌主要為不動桿菌屬、假單胞菌屬、腸桿菌科、副球菌屬4種。而通過PCR-DGGE分析后可知：富集后主要的反硝化聚磷菌為產堿桿菌屬、副球菌屬2種，僅有副球菌屬為2種方法同時獲得的唯一菌屬。這是因為利用平板分離技術，培養基單一，而且受到培養條件的限制，得到的菌種類有限；而利用 DGGE-PCR技術得到的菌種多樣、豐富，但是由于該方法也有其自身的局限性, 有些平板分離后的菌種仍無法被顯示, 因此，二者的試驗結果重合度并不高。其他菌種對系統反硝化除磷能力的貢獻還有待于進一步深入研究。

副球菌屬是唯一通過2種辦法獲得確認反硝化聚磷功能的菌株。周康群等[4]采用傳統方法從SBR反應器中分離的反硝化聚磷菌(DPB)以假單胞菌屬、棒狀桿菌屬為主，腸桿菌科和葡萄球菌屬次之。蔣軼鋒等[19]采用 PCR-DGGE技術分離的 DPB為 gamma-Proteobaccteria亞綱中的 Chromatiaceae屬(相似性98%)，Ahn等[20]采用PCR-DGGE技術分離的DPB主要有紅環菌屬 Rhodocyclus sp.(96%相似度)和Dechlorimonas sp. (97%同源性)，它們都是屬于變形菌。然而，通過 FISH只發現了紅環菌屬。Tsuneda等[21-22]從厭氧/好氧 SBR池中污泥分離到的 DPB為Thauera mechernichensis (83%相似度)和固氮弧菌屬Azoarcus tolulyticus (83%相似度)，其都屬于紅環菌屬。副球菌屬是國內外首次報道的反硝化聚磷菌。

2.2.5 PCR-DGGE法與16S rDNA克隆法的比較

本實驗中采用DGGE的結果檢測到的細菌有：黃桿菌屬(Flavobacteria綱，為bacteroidetes門)，產堿桿菌屬(β-proteobacteria 綱)，副球菌屬(α-proteobacteria綱)，紫色桿菌屬(β-proteobacteria 綱)，Erythrobacter sp.(赤 細 菌 屬 α-proteobacteria)即 以 變 形 門(proteobacteria)為主，此與焦中志等[14,23]的研究結果一致。焦中志等[14]采用平板分離法發現假單胞菌屬和產堿菌屬的脫氮除磷效果最好，采用DGGE法發現系統中反硝化聚磷菌優勢種群可主要分為7個群, 分別是 Anaerolineae(屬), Actinobacteria(放線菌綱),Bacteroidetes (擬桿菌門)，TM7，α-proteobacteria(變形綱)，δ-proteobacteria(變形綱)和 γ-proteobacteria(變形綱)菌群，其中，Actinobacteria(放線菌綱)和γ-proteobacteria為優勢的反硝化聚磷菌。而本試驗中發現經過富集培養以后產堿桿菌屬保持優勢，也從另一方面證明了產堿桿菌屬為反硝化聚磷菌。王海燕等[23]采用16S rDNA克隆文庫方法對高效同步脫氮除磷系統的細菌進行了多樣性研究。結果表明：系統中優勢細菌類群為Proteobacteria類群(變形菌類群)，占55.17%；細菌類群優勢順序為 γ-Proteobacteria類群(34.48%)，Bacteroidetes類群(似桿菌類群，20.69%)，β-Proteobacteria類群(12.07%)，Candidate division TM7類 群 (12.07%)， α-Proteobacteria 類 群 (5.17%)，δ-Proteobacteria 類群(3.45%)，Firmicutes類群(厚壁菌類群，3.45%)，Candidate division OP11類群(1.72%)和Planctom ycetes類群(浮霉狀菌類群, 1.72%)。因為克隆法所獲得的基因序列非常短，因此，很多細菌無法鑒定到屬，故研究系統內的微生物全面但不明確，而采用 PCR-DGGE法獲得的基因序列長達幾百，因此，細菌明確，但是，因為只能在某些較亮的光帶上才能提取基因序列，因此，無法全面反映系統中微生物的多樣性，故采用不同的研究方法、從不同的研究角度才能全方位了解系統內部微生物的多樣性和復雜性。

無論采用PCR-DGGE研究SB同步脫氮除磷系統和SBR池中的優勢菌，以及采用16S rDNA克隆文庫方法研究高效同步脫氮除磷系統的細菌，都以變形門(proteobacteria)占優勢。

3 結論

(1) 通過平板法分離到的微生物主要為棒狀桿菌屬、不動桿菌屬、假單胞菌屬、腸桿菌科、莫拉氏菌屬、葡萄球菌屬、副球菌屬共7種，富集后細菌主要為不動桿菌屬、假單胞菌屬、腸桿菌科、副球菌屬 4種，即富集后系統內細菌種類減少，與采用SBR池富集的反硝化聚磷菌種類不同。

(2) 采用DGGE法發現樣品富集前以黃桿菌屬、產堿桿菌屬、副球菌屬、紫色桿菌屬、赤細菌屬5種菌為主，富集后以產堿桿菌屬、副球菌屬、紫色桿菌屬3種屬為主，副球菌屬是唯一通過2種辦法獲得確認反硝化聚磷功能的菌株，國內外尚未見報道。

(3) Sludge bio-membrane(SB)同步脫氮除磷系統中采用PCR-DGGE法獲得的菌株與優勢菌不同，16S rDNA克隆文庫方法獲得的菌株更為豐富，但是，proteobacteria門為主在脫氮除磷的系統中都占優勢。

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