非小細胞肺癌中HLA-G的表達及其與IL-10的相關性

宋新宇 陳世雄 曾凡軍 高寶安 楊衛兵

(三峽大學第一臨床醫學院 宜昌市中心人民醫院呼吸內科，湖北 宜昌 443003)

HLA-G在腫瘤中的免疫抑制功能越來越受到關注。在惡性黑色素瘤〔1〕，腎細胞癌〔2〕，肺癌〔3〕，卵巢癌、乳腺癌〔4〕和神經膠質瘤中〔5〕均發現HLA-G蛋白的表達。HLA-G可阻止自然殺傷(NK)細胞的細胞溶解活性，誘導CD8+細胞毒性T細胞的凋亡和CD4+T細胞的同種增殖反應〔6〕。除這些細胞間的相互作用外，HLA-G還可通過調節細胞因子的釋放及促進輔助性T細胞比值(Th1/Th2)平衡向Th2方向的漂移來抑制免疫系統〔7〕。有報道顯示，Th2細胞因子中的IL-10誘導了HLA-G的表達，同時HLA-G似乎又反向刺激IL-10的表達〔8〕。而腫瘤細胞則可能通過該途徑對抗那些聚集到其周圍的免疫細胞〔9〕。本研究將探討HLA-G與IL-10在非小細胞肺癌標本中的表達及兩者的相關性。

1 材料與方法

1.1 患者和組織學標本 通過外科切除的方式獲得38例肺癌標本，這些患者術前均未接受放、化療。在切除腫瘤的同時獲取10例正常肺組織標本作為對照。這38位患者均來源于2007年5月至2008年6月間在華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院胸外科住院患者，年齡32～75(平均62±12)歲，其中男27例，女11例。組織病理學分型:腺癌18例，鱗癌12例，大細胞癌8例。病理學分期:Ⅰ期10例，Ⅱ期15例，Ⅲ期13例。所有組織標本被冰凍保存于－80℃。

1.2 RNA提取與cDNA合成 用RNA提取試劑盒(Invitrogen，USA)按照其說明書從冰凍組織樣本中提取總RNA。取1μg總RNA逆轉錄成cDNA存放于－20℃直到使用時。

1.3 實時定量PCR檢測HLA-G、IL-10 mRNA表達 用熒光實時定量PCR(Rotor-Gene RG-3000;Cobett Company，Australia)擴增目標cDNA序列。HLA-G和IL-10 PCR特異性擴增引物序列如下:HLA-G正義鏈5-CTGGAGAACGGGAAGGAGAT-3;反義鏈5-GGGTGGCCTCATAGTCAAAG-3。IL-10正義鏈5-ATGCACAGCTCAGCACTGC-3;反義鏈5-TCAGTTTCGTATCTTCATTGTC-3。β-actin正義鏈5'-TGAGCGCGGCTACAGCTT-3';反義鏈5'-TCCTTAATGTCACGCAGATTT-3'。

1.4 免疫組化法檢測HLA-G、IL-10蛋白表達 免疫組化反應中所用的抗體:抗人HLA-G單克隆抗體4H84(Santa Cruz，USA)，兔抗人IL-10多克隆抗體(BOSTER，CHINA)。以IL-10和HLA-G的染色陽性細胞數占細胞總數的百分比作為其標記指數。至少在4個視野進行細胞計數(200倍顯微鏡視野下)。

1.5 統計學分析 運用SPSS13.0統計軟件，正態資料用x±s表示，定性資料的統計用fisher精確概率法;定量資料的統計用t檢驗或方差分析，兩因素相關性分析用Spearman等級相關。

2 結果

2.1 非小細胞肺癌和正常肺組織中HLA-G、IL-10蛋白的表達38例肺癌標本中有21例(55.3%)HLA-G蛋白表達陽性，有23例(60.5%)IL-10表達陽性。而正常肺組織中沒有檢測到HLA-G和IL-10的蛋白表達。見圖1。

圖1 HLA-G和IL-10蛋白在肺癌組織中的表達(×200)

2.2 非小細胞肺癌和正常肺組織中HLA-G、IL-10 mRNA的表達 正常肺組織標本，均無HLA-G和IL-10 mRNA的表達。肺癌組織中HLA-G和IL-10 mRNA的表達量(2-△△Ct)分別是正常組織的 12.3倍(12.26±7.84，t=4.51，P＜0.01)和11.7倍(11.66 ±4.79，t=6.98，P ＜0.01)。

2.3 非小細胞肺癌中HLA-G和IL-10表達之間的關系 21例HLA-G蛋白表達陽性的肺癌標本中，有12例IL-10表達陽性，9例IL-10表達陰性，Spearman相關分析示，兩者在蛋白表達水平無明顯相關(r=－0.077，P=0.646)。兩者在mRNA水平也沒有明顯相關性(r=0.006，P=0.969)。

2.4 HLA-G與患者臨床病理因素的相關性 非小細胞肺癌HLA-G mRNA和蛋白表達均與肺癌TNM分期成正相關(r=0.913，P ＜0.001;r=0.429，P=0.007)，晚期非小細胞肺癌HLA-G的表達是增高的。除此之外，未發現其他臨床病理因素與HLA-G的表達相關。見表1。

表1 HLA-G mRNA和蛋白表達水平與肺癌患者臨床病理因素之間的關系

3 討論

雖然在腫瘤患者中，Th2細胞因子(IL-4，IL-5，IL-6和IL-10)與腫瘤發展之間的臨床關系未被完全闡釋清楚，但目前認為機體抗腫瘤免疫系統的損害與細胞因子平衡向Th2方向系統性轉移有關。IL-10作為一種重要的Th2類細胞因子，可表達于不同腫瘤細胞中〔10〕。此外，IL-10作為一種重要的免疫抑制因子，其在創造有助于腫瘤生存的免疫抑制微環境中發揮著多種生物學效應。Moreau等人研究結果顯示，在單核細胞中IL-10誘導HLA-G的表達可能起著下調免疫反應的作用〔8〕。同時Singer等也發現IL-10陽性細胞經常位于HLA-G陽性細胞周圍，HLA-G可能誘導了IL-10的表達〔4〕。先前也有研究表明，HLA-G能調節Th1/Th2細胞因子平衡朝Th2方向偏移，HLA-G被認為具有免疫調節作用〔11〕。由此推測，在腫瘤的發展過程中，HLA-G和IL-10可能通過相互調節而促進惡性腫瘤的轉移。

本研究發現在mRNA和蛋白水平HLA-G的表達與IL-10無相關性。由此推測，IL-10的表達可能是膜型HLA-G及其他多種因素共同作用的結果。已有相關研究顯示，無論是否有膜型HLA-G表達細胞的存在，可溶性HLA-G都可通過單個核細胞從另一方面增加 IL-10的產物〔12〕，且釋放入血的可溶性HLA-G可通過誘導T細胞凋亡〔13〕或誘導IL-10的產生〔14〕促使系統免疫無應答。所以肺癌中可溶性HLA-G與IL-10的關系有待進一步研究。此外，分析表明HLA-G mRNA和蛋白表達均與肺癌TNM分期呈正相關。晚期肺癌患者腫瘤細胞中HLA-G的表達較早期患者增高。這一結果提示，HLA-G可能在肺癌進展中起重要作用，并可能成為評估肺癌預后的指標。

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