SH-SY5Y神經細胞中α3尼古丁受體基因表達沉默對β分泌酶蛋白表達的影響

張雪玲 齊曉嵐 單可人 官志忠

(貴陽醫學院分子生物學重點實驗室，貴州 貴陽 550004)

阿爾茨海默病(AD)又稱老年性癡呆，是一種主要在老年期發生的以認知能力緩慢性進行性喪失為主要特征的神經退變性疾病。病理學上以細胞外老年斑(SPs)形成及神經細胞內神經原纖維纏結(NFTs)為主要特征〔1～3〕。SPs的主要成分為β-淀粉樣蛋白(Aβ)，是一種神經毒性物質，可以引起神經元的損傷和死亡，在 AD的發病中起著重要的作用。β-分泌酶(BACE)是啟動Aβ形成的關鍵限速酶。因此，BACE有望成為治療AD的作用靶點，為開發治療AD的提供了一條新思路〔4〕。神經型尼古丁受體(nAChR)與大腦學習記憶、智力發育和識別能力等腦功能有關，還具有明顯的神經保護作用〔5〕，在AD的發病中起著重要的作用。本課題組前期研究表明α3 nAChR具有一定的對抗Aβ的神經毒性作用，在AD的發病機制中具有重要作用〔6〕，但其具體機制是否與Aβ生成密切相關的BACE有關，有待進一步研究。本研究觀察α3 nAChR是否通過影響BACE蛋白表達從而減少Aβ的神經毒性作用。

1 材料與方法

1.1 試劑及設備 D-MEM培養液購自Gibco Invitrogen公司(英國);G418購自Sigma公司;普通化學試劑均購自Sigma公司;源于人腦的神經母細胞瘤細胞株(SH-SY5Y細胞)購于German Collection of Microorganisms and Cell Cultures公司(德國);穩定轉染α3 nAChR siRNA表達質粒及空質粒的SH-SY5Y神經細胞本課題組于2008年凍存于本實驗室液氮罐中;羊抗BACE1及BACE2、鼠抗β-肌動蛋白(β-actin)單克隆抗體及辣根過氧化物酶(HRP)標記的抗羊及抗鼠二抗購自Santa Cruz公司(美國)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 SH-SY5Y細胞為貼壁細胞。用含15%小牛血清、雙抗(青霉素100 U/ml，鏈霉素100 U/ml)的DMEM作為培養基，轉染 α3 nAChR pSilencer 3.1-H1 neo質粒的實驗組與轉染空質粒Negative control pSilencer 3.1-H1 neo的空質粒對照組，還需用含 0.4 mg/ml G418的培養液篩選，5%CO2、37℃恒溫培養。

1.2.2 SH-SY5Y細胞α3 nAChR基因沉默效果測定 采用Trizol(Invitrogen)一步法提取細胞總RNA。將mRNA逆轉錄反應成cDNA。以逆轉錄產物為模板進行Real-time PCR。所用試劑為 TaqMan Universal 2 ×PCR Mix，α3 nAChR(Hs01088199_m1)和內對照β-actin(4352935E)Taqman探針購自Applied Biosystems公司，ABI7300型熒光定量PCR儀采集待測基因及內參照 β-actin擴增各循環熒光信號，以 Applied Biosystems SDS1.4軟件進行熒光采集和數據分析。SDS1.4軟件分析其△△Ct值及 RQ(relative quantity)值，RQ=2-△△Ct。分析實驗結果時以β-actin為內對照，計算轉染α3 nAChR pSilencer 3.1-H1 neo質粒的實驗組與正常對照組及空質粒對照組間α3 nAChR mRNA和對照組的相對水平。用蛋白印跡方法檢測α3 nAChR蛋白表達水平。重復三次。

1.2.3 BACE蛋白表達水平測定 參照Guan等〔7〕的方法進行提取細胞蛋白并定量，加磷酸鹽緩沖液(PBS，4℃預冷)洗滌一次后用細胞刮收集細胞入1.5 ml無菌離心管中，再用PBS洗滌一次加入含苯甲基磺酰氟(PMSF)和復合蛋白酶抑制劑的細胞裂解液約40～60μl，置于冰上1 h，其間不時置于漩渦混勻器，使細胞充分裂解;12 000 r/min，4℃，離心40 min;小心吸取上清液至另一發泡聚丙烯(EPP)管;對上述制備的上清液進行蛋白定量后分裝，－20℃保存備用;用蛋白印跡方法檢測BACE1，BACE2蛋白表達水平。實驗重復三次。

1.3 統計學分析 應用 SPSS 14.0統計軟件進行分析，所得結果用x±s表示，兩因素析采用方差分析。

2 結果

2.1 穩定轉染α3 nAChR PSilencer 3.1-H1 neo質粒細胞株mRNA及蛋白表達水平 用Real-time RT-PCR及Western印跡方法檢測到SH-SY5Y細胞轉染α3 nAChR PSilencer 3.1-H1 neo質粒后mRNA和蛋白表達水平明顯下降(P＜0.01)，而轉染空質粒與正常對照組相比差異無顯著性。見表1，圖1。

圖1 穩定轉染α3 nAChR PSilencer 3.1-H1 neo質粒細胞株α3 nAChR蛋白表達

2.2 α3 nAChR基因表達沉默對SH-SY5Y細胞BACE蛋白表達水平的影響 SH-SY5Y細胞α3 nAChR基因表達沉默后，細胞BACE 1蛋白表達水平明顯增高(P＜0.01)，BACE 2蛋白表達水平明顯下降(P＜0.01)。見表2，圖2。

圖2 穩定轉染α3 nAChR PSilencer 3.1-H1 neo質粒細胞株BACE1及BACE2蛋白表達

表1 穩定轉染α3 nAChR PSilencer 3.1-H1 neo質粒細胞株α3 nAChR mRNA及蛋白表達(x ± s，n=3)

表2 穩定轉染α3 nAChR PSilencer 3.1-H1 neo質粒細胞株BACE1、BACE2蛋白表達水平(x ± s，n=3)

3 討論

nAChR是一類明確的具有神經保護功能的受體，與大腦學習記憶、智力發育和識別能力等腦功能有關，還調節多種受體的功能，并具有對抗細胞毒性神經保護作用，其含量減少與AD的發生有關，在SH-SY5Y神經細胞中α3是主要的尼古丁受體亞類之一，與AD的發病有關。但α3 nAChR對與Aβ生成密切相關的BACE的蛋白表達的影響尚未見報道。Aβ是由其APP經β-和γ-分泌酶水解后而形成，具有一定的神經毒性作用，可以引起神經元的損傷和死亡，只有完整的Aβ才能發揮神經毒性作用。BACE是啟動Aβ形成的關鍵限速酶，有兩個亞型即BACE1和BACE2。BACE1是具有BACE活性的天門冬氨酸蛋白酶，俗稱BACE1或BACE。研究表明純化的BACE1蛋白的確在BACE的作用位點進行切割〔8〕，從而增加神經毒性物質Aβ的生成。在發現 BACE1不久，發現了其同源蛋白稱為BACE2。研究表明，BACE2雖能在BACE位點裂解APP，但它在Aβ結構域內部的裂解更有效，因此BACE2可抑制神經毒性物質的Aβ生成〔9〕。本課題組前期研究顯示α3 nAChR具有一定對抗Aβ的神經毒性作用，其是否與β分泌酶有關未見報道。本課題組構建了SH-SY5Y細胞α3 nAChR siRNA真核表達載體，并且有效地表達了針對α3 nAChR的siRNA，將其轉染至SH-SY5Y細胞，采用實時熒光定量(RT-PCR)和蛋白印跡方法分別對α3尼古丁受體基因mRNA和蛋白水平進行了分析。結果表明，由siRNA介導沉默后α3尼古丁受體基因的表達及蛋白的表達均明顯下降，且下降程度基本一致。結果表明小分子干擾RNA能有效地抑制內源性α3 nAChR基因的表達。本研究結果顯示穩定轉染α3 nAChR siRNA表達質粒的細胞克隆株，與空質粒及正常對照組相比BACE1蛋白表達水平增加，BACE2蛋白表達水平減少，表明α3 nAChR能夠增加BACE2蛋白表達水平及減少BACE1蛋白表達水平而影響Aβ的生成從而對抗Aβ的神經毒性作用，發揮神經保護作用。

1 Nordberg A.Nicotinic receptor abnormalities of Alzheimer's disease:therapeutic implications〔J〕.Biol Psychiatry，2001;49(3):200-10.

2 Doody RS，Stevens JC，Beck C.Practice parameter:management of demen-tia(an evidence-based review)〔J〕.Neurology，2001;56(9):1154-66.

3 Paterson D，Nordberg A.Neuronal nicotinic receptors in the human brain〔J〕.Prog Neurobiol，2000;61(1):75-111.

4 Hong L，Turner RT，Koelsch G，et al.Memapsin 2(beta-secretase)as a therapeutic targe〔tJ〕.Biochem Soc Trans，2002;30(4):530-4.

5 Kihara T，Shiohama S，Sawasa H，et al.Nicotinic receptor stimulation protects neurons against β-amyloid toxity〔J〕.Ann Neurol，1997;42(2):159-63.

6 唐 智，齊曉嵐，單可人，等.SH-SY5Y神經細胞中尼古丁受體α3亞單位基因表達抑制與APP代謝的關系〔J〕.中國老年學雜志，2009;29(21):2749-51.

7 Guan ZZ，Miao H，Tian JY，et al.Suppressed expression of nicotinic acetylcholine receptors by nanomolar beta-amyloid peptides in PC12 cells〔J〕.J Neural Transm，2001;108(12):1417-33.

8 Vassar R，Bennett BD，Babu-Khan S，et al.Beta-secretase cleavage of Alzheimers amyloid precursor protein by the transmembrane aspartic protease BACE〔J〕.Science，1999;286(5440):735-41.

9 Vassar R，Citron M.Aβ-generating enzymes:recent advances inβ-andγsecretase research〔J〕.Neuron，2000;27(3):419-22.