硫酸鎂對小鼠全腦缺血再灌注損傷的保護作用

楊衛東 董銀鳳 朱旭友 呂鴻燕 陳前芬

(蚌埠醫學院機能實驗中心，安徽 蚌埠 233030)

缺血性腦卒中具有發病率高、死亡率高、致殘率高等特點，因此缺血性腦卒中的防治成為社會和醫學界關注的重要課題。研究表明N-甲基-D-天門冬氨酸(NMDA)受體介導的神經興奮毒性在缺血性腦損傷中起關鍵的作用。當NMDA受體興奮時，大量Ca2+內流引起鈣超載。Mg2+是Ca2+的天然拮抗劑，可通過非競爭性抑制NMDA受體來有效減少Ca2+內流，從而改善腦組織細胞損傷〔1〕。近年引起人們的重視。本研究利用小鼠全腦缺血再灌注損傷模型，通過觀察硫酸鎂(MgSO4)預處理及治療對小鼠全腦缺血再灌注一氧化氮(NO)、一氧化氮合酶(NOS)及ATP酶的影響，探討MgSO4對腦缺血再灌注損傷的保護作用及可能機制。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑與儀器 MgSO4注射液(購于揚州中寶公司)，NOS及NO測定試劑盒及鈉鉀、鈣鎂ATP酶活性測定試劑盒(均購自南京建成生物工程研究所)。FSH-2型高速電動勻漿器(江蘇金壇醫療儀器廠產)，756-MC型紫外分光光度計(上海精密科學儀器有限公司產)。

1.2 動物與分組 健康昆明種小鼠80只，體重(25±5)g，雌雄兼用，由我院實驗動物科提供。隨機均分為以下各組，假手術組:僅行手術，不實施腦缺血;再灌組:缺血30 min，再灌注1 h;MgSO4預處理組和治療組各分為低、中、高劑量組，分別于缺血前 30 min腹腔注射25、50、100 mg/kg MgSO4，然后缺血30 min，再灌注 1 h，和再灌后即刻給予腹腔注射 90、180、360 mg/kg MgSO4。前兩組腹腔注射等體積生理鹽水。

1.3 全腦缺血/再灌注損傷動物模型的建立 10%水合氯醛(0.35 ml/100 g)小鼠腹腔注射麻醉。采用我室改進的小鼠全腦缺血/再灌注損傷的動物模型〔2〕。全腦缺血30 min，予以解壓再灌60 min。

1.4 標本制備及處理 各組動物動態觀察到預定的時間后，用20%烏拉坦過量麻醉處死，開顱，取左側大腦皮質，稱重，制成10%組織勻漿，硝酸還原法測定NO含量，測定誘導型一氧化氮合酶(iNOS)、總一氧化氮合酶(T-NOS)活性及考馬斯亮藍法測定蛋白含量。右半大腦10%甲醛溶液固定，48 h后于乳頭體及視交叉平面行冠狀切開，制成腦片，HE染色，光鏡觀察腦皮層病理學變化。

1.5 統計學方法 采用應用SPSS14.0統計軟件包進行單因素方差分析和q檢驗及t檢驗。

2 結果

2.1 病理學檢查結果 假手術組神經細胞胞膜清晰完整，無變性、水腫，核仁清晰可見。再灌注組神經細胞及膠質細胞均腫脹、變性壞死，胞膜不清，胞核固縮，神經纖維網呈空泡樣改變，間質水腫明顯，細胞及血管周圍間隙增大。硫酸鎂治療和預處理各用藥組神經細胞水腫程度有一定減輕，神經細胞及間質僅有輕微水腫，核仁清晰，腦各部位結構及層次較再灌組清楚各組之間差別不明顯，見圖1。

2.2 大腦內NO含量和NOS、iNOS活性的變化 表1可見，腦內NO含量和NOS、iNOS活性缺血再灌注組均高于假手術組，有顯著性差異(P＜0.01);MgSO4治療組和預處理各組腦組織T-NOS和iNOS活性及NO含量均低于再灌組有顯著性差異(P＜0.01)，MgSO4治療組各不同劑量治療組間均有差異(P＜0.05)。MgSO4預處理高劑量組的T-NOS活性與中、低劑量組比較有顯著性差異(P＜0.05)，而中劑量組與低劑量組比較無顯著性差異(P＞0.05)。NO含量、iNOS活性不同劑量MgSO4預處理各組間相比均無差異(P＞0.05)。MgSO4治療組和預處理T-NOS和iNOS活性的有顯著性差異(P＜0.01);NO含量高劑量組比較有顯著性差異(P＜0.05)。

表1 各組小鼠腦組織NO、T-NOS和iNOS活性比較(x ± s，n=10)

圖1 病理學檢查結果(HE，×400)

2.3 鈉鉀、鈣鎂-ATP酶 缺血再灌注組鈉鉀、鈣鎂-ATP酶的活性均低于假手術組和治療組、預處理組有顯著性差異(P＜0.05)。鈉鉀ATP酶預處理與治療組之間的差異沒有統計學意義(P＞0.05);鈣鎂ATP酶預處理與治療組間有統計學意義(P＜0.05)。見表2。

表2 鈉鉀-ATP酶、鈣鎂-ATP酶活性比較(x ± s，n=10)

3 討論

隨著對腦損傷機制的認識深入，MgSO4作為一種價廉而有效的腦保護劑備受人們關注，目前眾多研究表明，MgSO4是生理性的鈣拮抗劑和ATP酶活化劑〔1〕，還可以提高缺血組織中SOD等抗氧化酶活性，清除氧自由基〔3〕，抑制膜脂質過氧化反應，減輕自由基損傷。李鍵等〔4〕實驗表明，MgSO4預處理能降低NO含量和GSH活性，對人臍靜脈內皮細胞缺氧再復氧損傷起保護作用。我們的實驗結果表明在小鼠全腦缺血再灌注損傷時腦內的iNOS及NO均顯著增加，腦組織病理學顯示腦組織的損傷加重。無論是MgSO4預處理還是治療均能減少iNOS及NO合成，組織病理學檢查也提示腦組織損傷明顯減輕。從而表明，腦缺血再灌注損傷后，腦內興奮性氨基酸增多，NMDA受體激活，大量Ca2+內流，還可增加iNOS mRNA的轉錄，從而升高細胞內NOS表達的水平。在NOS的作用下NO迅速合成，介導神經細胞損傷〔5〕。Mg2+是天然的鈣離子拮抗劑，同時作為一種非競爭性興奮性氨基酸(EAA)受體拮抗劑，具有阻斷NMDA受體，可阻滯興奮性氨基酸受體介導的鈣內流，減輕興奮性毒性損傷的作用，并通過阻滯Ca2+內流而最終抑制有害iNOS及NO合成，減輕腦組織損傷。

實驗和臨床均發現，急性缺血性腦卒中的動物或患者體內都存在著嚴重的低鎂。Lampl等〔6〕對96例24～48 h以內急性缺血性卒中患者入院時查血清和腦脊液鎂離子濃度，并用Mathew評分法評分，結果發現，缺血性卒中發生后48 h神經功能缺損的程度與腦脊液鎂濃度低有關。Heath等〔7〕用磷核磁共振波譜學方法研究證實，腦損傷時MgSO4和MgCl2均能透過血腦屏障進入損傷組織。Fuchs-Buder等〔8〕對20例神經外科病人靜脈注射MgSO4時鎂通過血腦屏障的研究證明，病人經靜脈一次注射MgSO460 mg/kg，在注射后30、90和240 min時血清和腦脊液鎂離子濃度均增加。我們的實驗證明，隨著鎂濃度增高可提高對腦的保護作用，MgSO4血藥濃度與療效呈正相關。治療組在降低iNOS活性及NO含量作用比預處理組更明顯。

Mg2+是體內一種內源性保護因子，是體內許多重要酶的輔助因子。不僅是生理性鈣拮抗劑還是ATP酶活化劑，在ATP的代謝和跨膜離子傳遞中起著極重要的作用。ATP酶是逆離子濃度梯度進行細胞膜內外轉運的離子泵，此過程需要能量。腦血流一旦完全阻斷，ATP耗盡，膜離子泵功能障礙，K+流出，Na+、Ca2+和水大量進入細胞內。導致細胞腫脹，使梗死灶周圍去極化，半暗帶功能損害。我們的實驗也表明，腦缺血再灌注損傷后，Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性均顯著降低。組織病理學表明腦缺血再灌注損傷后神經細胞及膠質細胞均極度腫脹。皮層充血，間質水腫明顯。MgSO4預處理或治療后均顯示:Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性均增高。腦組織輕度腫脹。變性壞死神經細胞水腫程度減輕明顯。表明提高細胞外Mg2+可抑制K+外流，并可拮抗Ca2+離子內流，從而減少自由基的產生，防止了神經細胞的壞死與凋亡，保障了細胞膜的穩定性。

1 黃 越，王維治，張玉梅，等.硫酸鎂對大鼠急性缺血再灌注損傷時ATP酶的影響〔J〕.中國神經免疫學和神經病學雜志，2002;9(3):153-6.

2 陳前芬，祝曉光，楊衛東，等.小白鼠全腦缺血∕再灌注損傷模型的改進〔J〕.中國藥理學通報，2000;16(5):577-9.

3 李增宏，羅 俊，林宏城，等.硫酸鎂注射液對大鼠腎缺血再灌注損傷的保護作用〔J〕.中山大學學報論叢，2007;27(3):152-4.

4 李 鍵，董果雄，馮義柏.硫酸鎂預處理對人臍靜脈內皮細胞缺氧再復氧損傷的保護作用〔J〕.中國老年學雜志，2006;26(9):1247-8.

5 季占勝，唐學東，閔連秋.硫酸鎂的腦保護作用〔J〕.醫學綜述，2005;11(7):666-8.

6 Lampl Y，Geva D，Gilad R，et al.Cerebrospinal fluid magnesium level asa prognostic factor in ischemic stroke〔J〕.JNeurol，1998;245(9):5842-8.

7 Heath DL，Vink R.Neuroprotective effects of MgSO4and MgCl2in closed head injury:a comparative phosphorus NMR study〔J〕.J Neurotrauma，1989;15(3):183-9.

8 Fuchs-Buder T，Tramer MR，Tassonyi E.Cerebrospinal fluid passage of intravenous magnesium sulfate in neurosurgical patients〔J〕.JNeursurg Anesthesiol，1997;9(4):324-8.