康腦液2號對局灶性腦缺血再灌注大鼠的治療作用及其機制

梁起保 薛 茜 趙秀芳 石會娟 鄒玉安

(河北北方學院，河北 張家口 075000)

腦血管疾病是我國位居第三的致死因素，其中缺血性腦血管病(ICVD)可占56.6% ～80%，患者總人數可達(500～600)萬，存活者有約75%的高致殘率〔1〕。本實驗通過觀察經驗方康腦液2號對腦缺血再灌注(I/R)大鼠的治療作用，并從促血管新生的角度研究其治療機制，為其防治ICVD提供理論依據，也為補氣活血法治療老年腦梗死提供依據。

1 材料與方法

1.1 藥品及試劑 康腦液2號:黃芪、當歸、川芎、三七、葛根、地龍、丹參、鉤藤(后下)等組成(購于河北北方學院第一附屬醫院)。冷水浸泡一夜，煎煮2次，濾出藥渣，將2次煎取的藥液混勻，文火分別濃縮成400%、200%、100%康腦液2號(每 ml含生藥 4、2、1 g)，4℃冰箱保存。多聚甲醛(購自美國Sigma公司)。MCAO栓線(北京沙東)，兔抗大鼠 Ang-1、VEGF、CD105一抗體及相應二抗(武漢博士德公司)。

1.2 主要實驗儀器 電腦生物組織包埋機(浙江金華科迪)，石蠟切片機(美國Thermo)，電腦生物組織攤烤片機(浙江金華科迪)，光學顯微鏡(日本OLYMPUSBX60型)，顯微攝影裝置(日本NIKON)，自動脫水機(美國Thermo)。

1.3 實驗動物分組及給藥 SPF級雄性SD大鼠150只，體重200～280 g，購自北京大學醫學部動物中心〔許可證號SCXK(京)2006-0008〕。隨機分為:假手術組、模型組、康腦液2號高(28.6 g·kg－1·d－1)、中(14.3 g·kg－1·d－1)、低(7.15 g·kg－1·d－1)劑量組，每組24只，手術組缺血2 h，從手術后12 h開始灌胃給藥，每天1次，直至處死。給藥劑量按大鼠與人體表面積等效劑量折算，假手術組及模型組灌胃等體積生理鹽水。根據改良Longa方法，線栓經右側頸外動脈插線建立右側大腦中動脈阻塞(MCAO)法制作大腦I/R模型。

1.4 大鼠神經功能評分 參照Longa 5分制評分方法對各個實驗動物的神經行為學進行評分。分別于大鼠蘇醒時及I/R 24 h后進行評分:0分，無神經系統損傷癥狀;1分，不能完全伸展對側前爪;2分，向左側轉圈;3分，向對側傾斜;4分，不能自發行走，意識喪失。

1.5 HE染色及VEGF、Ang-1蛋白檢測 于再灌注每個時間點，取每組另外6只大鼠，10%水合氯醛(300 mg/kg)ip麻醉，經左心室插管至升主動脈，依次灌入生理鹽水150 ml、4%多聚甲醛200 ml前固定至肢體變硬，開顱取腦，于前囟前2 mm至前囟后3 mm切腦，切塊厚度5 mm，置入4%多聚甲醛中后固定12～24 h，常規梯度乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟，包埋。切片3μm，HE染色觀察腦梗后病理變化，采用免疫組織化學(SP二步法，按說明操作)檢測VEGF及Ang-1蛋白表達。

1.6 血管密度檢測 免疫組織化學方法標記CD105顯示新生血管，步驟同上。切片經圖像分析儀分析系統處理，參照Weidner法〔2〕進行微血管密度(MVD)計數，每份標本均選5個高倍視野(200×)計數微血管數目后取平均值為平均微血管數(MMVC)，以 MMVC/mm2表示 MVD(200×/高倍視野等于0.042 6 mm2)。

1.7 統計學處理 采用SPSS16.0軟件，數據以x±s表示，采用單因素方差分析(ANOVA)，組間兩兩比較用SNK法。

2 結果

2.1 各組神經功能評分比較 與假手術組比較，模型組大鼠神經功能行為評分顯著升高(P＜0.01);與模型組比較，康腦液2號治療組大鼠顯著降低(P＜0.05或P＜0.01)，但是顯著高于假手術組，康腦液2號高中劑量組顯著低于低劑量組(P＜0.05)，但高中劑量兩組無顯著差異(P＞0.05)，見表1。

2.2 各組大鼠HE改變 光鏡下可見模型組梗死明顯，梗死主要位于基底節、皮質下白質和皮層，缺血區神經細胞明顯減少，殘存神經細胞胞體縮小變性，細胞核固縮，胞質深伊紅染色，神經元纖維疏松，間質水腫明顯，血管減少。康腦液2號治療組可見梗死范圍縮小，水腫程度也較輕，神經元形態改變較輕，胞體完整，突起較清楚，基本保持完整。血管較模型組明顯增多。見圖1。

表1 各組大鼠神經功能評分(n=24)和腦血管密度(n=6，血管數/mm2)比較(x±s)

圖1 各組大鼠腦病理改變(HE，×100)

2.3 腦組織VEGF及Ang-1免疫組化結果 VEGF及Ang-1陽性表達可見胞質呈棕黃色，可表達于神經細胞、膠質細胞及血管內皮細胞。與假手術組相比，模型組VEGF及Ang-1蛋白表達顯著增強(P＜0.05或P＜0.01)。和模型組相比，康腦液2號治療組VEGF及Ang-1表達顯著增高(P＜0.05或P＜0.01)，不同的是，VEGF表達高峰在7 d，Ang-1表達高峰在14 d。康腦液2號高、中劑量治療組之間無顯著差異，但結果都明顯高于低劑量組(P＜0.05)。見表2及圖2。

圖2 各組大鼠VEGF、Ang-1和血管表達的比較(免疫組化，×400)

2.4 大鼠腦組織血管密度結果 空白組及假手術組陽性血管表達較少，模型組血管密度顯著高于空白組(P＜0.01)，與模型組相比，康腦液2號各治療組血管密度顯著增高(P＜0.05或P＜0.01)，康腦液2號高中劑量組促血管新生能力顯著強于低劑量組(P＜0.05)，見表1及圖2。

表2 各組大鼠VEGF和Ang-1的比較(×400，x ±s，個數/視野，n=6)

3 討論

腦缺血缺氧后出現一系列變化，包括炎癥反應、自由基超載、毒性氨基酸釋放等，神經功能和腦組織病理改變是最直接客觀的改變。但腦缺血缺氧的一系列改變歸根結底是腦組織缺血導致，如果能及時恢復血供無疑是治療腦缺血的主要手段。臨床工作中早期T-PA溶栓顯示較好的臨床效果證實了這一點。但T-PA溶栓指征苛刻，臨床上適合溶栓的病人非常少，研究一種能促進腦缺血周圍組織血管新生的方法成為治療ICVD的重要策略。近幾年，科學家們研究了各種治療性血管新生，包括細胞療法、蛋白療法等，但不僅價格昂貴，安全性也不可靠，中藥憑借其多靶點、副作用小、經濟便宜等優點成為了促血管新生的研究重點。

血管新生是在缺血組織已有的血管床上，內皮細胞以牙生方式長出新支，形成血管網使其功能與局部需要相適應的生物學過程，主要靠促血管新生因子來促其生成。VEGF是迄今發現最重要一種促血管生成因，一方面能高選擇地促進血管內皮的有絲分裂，進而促進血管內皮新生;另外，其還能增加血管內皮通透性，使血漿大分子物質滲透到血管的基質中，從而為新的血管提供營養物質〔2〕。Ang-1在血管新生過程中發揮著重大作用，主要機制如下:①使血管內皮細胞趨化、聚集，吸引周細胞形成新生血管;②拮抗內皮細胞凋亡;③促進血管內皮細胞遷移和形成管狀結構，加強VEGF等血管穩定作用;④調節內皮細胞和血管平滑肌細胞，促進血管重塑、成熟，維持血管的完整性和穩定性〔3〕。CD105不與大血管內皮細胞反應，但對新生血管反應性強，即與“活化”的內皮細胞反應性強，而對組織中正常的靜止狀態下的血管內皮細胞反應性差〔4〕。本實驗選擇VEGF、Ang-1、CD105作為觀察血管新生的指標更有說服性。

ICVD隸屬中醫中風范疇，“素體氣虛，不能行血，以致血瘀”是其主要發病理論，補氣活血法能夠“行氣通脈、活血化瘀”，是老年性腦梗死的主要治法。康腦液2號是臨床使用多年的經驗方，適合氣虛血瘀患者，由補氣活血的鼻祖方補陽還五湯按照現代人的特點化裁而來，君以大量黃芪大補脾胃元氣，使得氣旺血行，瘀去絡通，并且活血祛瘀而不傷正。當歸善于活血養血，有化瘀而不傷血之妙，并和黃芪1:5配伍為當歸補血湯，充養脈絡，是為臣藥。川芎、葛根、地龍、三七、丹參等助當歸活血化瘀，為佐藥。鉤藤、天麻引藥上行，是為使藥，君臣佐使共奏補氣活血化瘀之功。補氣活血法促血管新生研究頗多，田兆華〔5〕等實驗證實補陽還五湯能明顯增多缺血腦組織新生血管數目。劉清君等〔6〕明確了當歸補血湯有明顯的促血管新生作用。其余各藥對腦梗死的治療作用均有研究，有的已經在臨床使用，比如川芎、丹參、葛根等。

綜上，康腦液2號對腦I/R發揮較好的治療作用，其機制可能是其促進VEGF、Ang-1等促血管新生因子的表達，而使缺血周圍區域血管新生增加。

1 Jia Q，Liu LP，Wang YL.Stroke in China〔J〕.Clin Exp Pharmacol Physiol，2010;37(2):259-64.

2 Wang YQ，Guo X，Qiu MH，et al.VEGF overexpression enhances striatal neurogenesis in brain of adult rat after a transient middle cerebral artery occlusion〔J〕.JNeurosci Res，2007;85(1):73-82.

3 劉 帥，劉學政.Ang-1/Tie2系統與病理性血管形成的關系〔J〕.解剖科學進展，2010;16(1):85-8.

4 于建憲，常 宏，紀 萍.CD105、CD34及Ⅷ因子在不同生理狀態下子宮內膜中的表達〔J〕.齊魯醫學雜志，2005;20(3):189-91.

5 田兆華，劉柏炎.補陽還五湯對局灶性腦缺血大鼠血管新生的影響〔J〕.中國動脈硬化雜志，2010;18(3):193-8.

6 劉清君，李應東，劉彩梅，等.當歸補血湯超濾膜提取物對雞胚絨毛尿囊膜血管新生的影響〔J〕.中西醫結合心腦血管病雜志，2008;6(4):420-1.