mB7-1修飾的B16細胞體外誘導免疫效應

金洪娟 王 權 所 劍

(吉林大學第一醫院，吉林 長春 130021)

機體抗腫瘤免疫應答主要效應細胞為T細胞，其活化需要抗原信號和協同共刺激信號雙信號的作用，共刺激信號的缺乏將導致T細胞不能活化或凋亡。B7-1是最主要的共刺激分子之一，而大多數腫瘤細胞均不表達或低表達B7分子，這正是腫瘤免疫逃避的機制之一。因此將共刺激分子B7-1基因導入腫瘤細胞可增強其免疫原性，誘導宿主有效的抗腫瘤免疫效應。本實驗主要目的是在體外建立穩定表達mB7-1的細胞系，為其進一步抗瘤研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與材料 動物:BALB/c小鼠，購于吉林大學白求恩醫學部基礎醫學院實驗動物部。試劑與設備:IMDM培養基，反轉錄酶，TRIzol試劑，Oligo(dT)，DEPC，均購自美國 GIBCO公司;10%小牛血清購自華美生物公司;EcoRⅠ和XhoⅠ內切酶購自Bochring Mannheim;pcDNA3質粒購自Invitrogen公司;淋巴細胞分離液購自上海華精生物技術有限公司;MTT購自美國Sigma公司。

1.2 重組載體的構建

1.2.1 mB7-1引物的設計與合成 參考GenBank報道序列自行設計mB7-1基因引物序列。B7-1基因引物序列:擴增片斷為940 bp，上游及下游分別引入EcoRⅠ和XhoⅠ兩個多克隆酶切位點和起始信號ATG、終止信號TAG，上游P1:5'-AGCTGAATTCATGGCTTGCA-3';下游 P2:5'-AGCTCTCGAGCTAAAGGAAG-3'。由寶生物生物工程公司合成。

1.2.2 mB7-1目的基因的獲得 采用TRIzol試劑法提取BALB/c純系小鼠mRNA，合成為cDNA。應用引物P1及P2進行 RT-PCR，反應體系如下:小鼠cDNA 1 μl，引物 各1 μl，dNTP 4 μl，rTaq 酶0.5 μl，10 × Buffer 5 μl，甘油2.5 μl，石蠟25 μl，雙蒸水10 μl。循環參數:94℃變性1 min，55℃退火 30 s，72℃延伸1 min，以上反應條件進行30個循環。回收PCR產物及pcDNA3質粒雙酶切(EcoRⅠ和XhoⅠ)后進行連接反應。連接產物經體外擴增后酶切鑒定并送交生物技術公司進行全長基因序列測定。

1.3 mB7-1轉染B16細胞 取凍存B16細胞進行復蘇與傳代培養，鑒定后質粒應用脂質體法進行轉染。48～72 h后更換培養基進行篩選，培養6～8 w，獲得穩定轉染細胞株。收集篩選陽性細胞株，提取細胞總RNA，以前述引物1、2進行RT-PCR，檢測基因水平表達，mB7-1 PCR產物作為陽性對照。

1.4 體外殺傷效應的檢測 B16、轉染后mB7-1-pcDNA3-B16及pcDNA3-B16腫瘤細胞(1×105ml/L)各1 ml加入絲裂霉素 C 30 ng/ml，37℃、5%CO2孵箱中孵育45 min，洗滌后制備成細胞懸液，培養 36 h。收集淋巴細胞，調細胞濃度至5×106ml/L;以前述3組細胞為靶細胞，效價比為10∶1，混合培養16 h后加入MTT試劑10μl/孔孵育8 h。離板后棄上清，加入DMSO 100μl/孔，酶聯免疫檢測吸光度(A)。抑制率計算:抑制率=〔1-(實驗孔A值-效應細胞對照孔A值)/靶細胞對照孔A值〕×100%。

1.5 統計學分析 采用t檢驗。

2 結果

2.1 載體構建 連接產物經EcoR I和Xho I雙酶切反應后，酶切產物電泳可見兩條亮帶，小片段約1 000 bp大小，大片段位于5 000 bp左右，總和約6 000 bp，符合預測結果(見圖1)。生物公司測序結果經軟件與GenBank報告mB7-1基因序列對比分析后顯示所得目的基因序列與已報道序列一致。

2.2 mB7-1轉染B16細胞基因表達 轉染mB7-1-pcDNA3后腫瘤細胞組逆轉錄PCR產物電泳可見特異性條帶，大小與陽性對照mB7-1基因片段大小一致，轉染pcDNA3腫瘤細胞組及空白對照組未見特異性條帶產生(見圖2)。

2.3 殺傷活性檢測 各組細胞均誘導產生殺傷效應，而與對照組〔B16組(36.20±1.3)%，B16-pcDNA3組(40.12±1.1)%〕比較，轉染mB7-1-pcDNA3后腫瘤細胞組的殺傷活性〔(76.09±1.5)%〕顯著高于其他兩組(P＜0.05)。

圖1 mB7-1-pcDNA3酶切鑒定結果

圖2 mB7-1基因瞬時表達

3 討論

免疫學研究關于免疫效應細胞的雙信號學說認為T細胞活化與增殖依賴于雙信號，一是抗原遞呈細胞(APC)呈遞的抗原肽——人類白細胞抗原(HLA)復合物，由特殊T細胞抗原受體(TCR)識別，并將信號傳遞給T細胞;此信號對T細胞活化是必需的，但不引起T細胞增生和分泌細胞因子。二是共刺激信號(第二信號)，共刺激信號為T細胞抗原特異性激活所必需，決定了T細胞是活化增殖、抑或轉變為無反應狀態甚至凋亡〔1〕。B7-1分子存在于活化的B細胞、T細胞、樹突狀細胞及IFN-γ活化的單核細胞表面，其受體為CD28/CTLA4，表達于T細胞表面〔2，3〕。CD28與 B7-1結合，啟動協同刺激信號，在提高T淋巴細胞的反應性、誘導抗凋亡基因表達、增加細胞因子的分泌(尤其是IL-2)、促進T淋巴細胞與APC的結合和阻止T淋巴細胞的失能(anergy)等方面有著重要的作用，而B7-1與CTLA-4 結合則起到抑制作用〔4，5〕。Martin 等〔5〕將轉 B7 基因的K1735腫瘤細胞注入未經免疫的同系小鼠，則發生急性排斥反應。將B7基因導入腫瘤細胞，提高特應性CTL的活性，達到殺傷腫瘤細胞的作用。

本實驗根據雙信號理論，選取共刺激分子mB7-1作為實驗對象，針對絕大多數腫瘤細胞缺乏共刺激分子這一點，期望通過彌補或增強共刺激信號表達，提高腫瘤的免疫原性，從而誘導或增強CTL(特異性細胞)對腫瘤細胞的免疫識別和殺傷作用。本實驗應用基因體外合成技術獲得目的基因片段mB7-1，于體外構建重組mB7-1-pcDNA3真核表達載體，經酶切電泳鑒定獲得大小約1 000 bp片段，經測序后證實與GenBank中mB7-1序列一致。此后采用脂質體介導的方法轉染小鼠B16腫瘤細胞，經篩選獲得穩定轉染細胞株，應用RT-PCR方法獲取的基因產物與鑒定后的mB7-1目的基因片段大小一致，而空白對照組無對應產物出現，從而在基因水平證實了該細胞系存在mB7-1的表達。將該靶細胞與效應細胞共混培養后，可發現誘導淋巴細胞活化，產生了有效的殺傷作用，并且mB7-1陽性組明顯高于其他兩組。實驗結果表明轉染B7共刺激分子后可增強腫瘤細胞的免疫原性，增強體外抑瘤效應，也驗證上述雙信號學說，表明B7共刺激分子可作為腫瘤基因治療的靶點，為下一步的抗瘤研究奠定了良好的基礎。

1 Bugeon L，Dallman MJ.Co-stimulation of T cells〔J〕.Am J Respir Crit Care Med，2000;162(1):164-8.

2 Collins M，Carreno BM.The B7 family of ligands and its receptors:new pathways for costimulation and inhibition of immune responses〔J〕.Ann Rev Immunol，2002;20(1):29-53.

3 Judith L，Katharina GP，Peter S.Receptor and ligands implicated human T cell costimulatory process〔J〕.Immunol Lett，2010;128(2):89-97.

4 Shi T，Kennedy G，Gorski K，et al.Cooperative B7-1/2(CD80/CD86)and B7-DCcostimulation of CD4+T cells independent of the PD-1 receptor〔J〕.JExp Med，2003;198(1):31-8.

5 Manish JB，Victor PC，Gordon JF，et al.Interaction of human PD-L1 and B7-1〔J〕.Mol Immunol，2008;45(13):3567-72.