淫羊藿苷對(duì)D-半乳糖致衰老模型小鼠睪丸病變的影響

陳 凱 劉浩然 蘇燕慧 喻蘇青 齊敏友

(浙江工業(yè)大學(xué)，浙江 杭州 313000)

衰老的特征之一為性腺功能的退化〔1，2〕。從50歲開(kāi)始，男性睪丸組織就出現(xiàn)退行性變化;睪丸重量減輕，生精細(xì)胞散在分布或者缺無(wú)，支持細(xì)胞稀少，間質(zhì)細(xì)胞隨年齡遞減，血清睪酮水平下將〔3，4〕。以D-半乳糖皮下注射可造成實(shí)驗(yàn)動(dòng)物快速衰老，在性腺的損傷方面可表現(xiàn)出與自然衰老相似的特征〔5〕。淫羊藿是傳統(tǒng)的補(bǔ)腎藥，淫羊藿苷是其主要的有效成分之一，目前研究表明，其可明顯促進(jìn)幼年小鼠附睪及精囊的發(fā)育〔6〕。本實(shí)驗(yàn)以D-半乳糖造成小鼠衰老模型，觀察淫羊藿苷對(duì)衰老小鼠睪丸組織特異性酶類、氧化應(yīng)激指標(biāo)的改變，并從病理組織學(xué)觀察其對(duì)睪丸病變的影響，了解淫羊藿苷對(duì)衰老小鼠睪丸病變的作用，為其防治男性睪丸病變提供藥理學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 健康雄性昆明種小鼠32只，體重(20±2)g。由浙江醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。合格證號(hào):SCXK(浙)2008-0033。

1.1.2 藥物、試劑及儀器 淫羊藿苷(規(guī)格:98%，HPLC)，由西安小草植物科技有限公司提供，淡黃色粉末;D-半乳糖(Amresco)分裝，南京生興生物技術(shù)有限公司提供?？捡R斯亮藍(lán)測(cè)試盒、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、乳酸脫氫酶(LDH)、酸性磷酸酶(ACP)、谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(γ-GT)試劑盒，由南京建成生物工程有限公司提供。睪酮檢測(cè)試劑盒，由天津九鼎生物工程有限公司提供。紫外分光光度計(jì)、離心沉淀機(jī)(鞏義市英峪予華儀器廠)、電子天平(型號(hào)104，Made by Mettler-Toledo Group)、恒溫水浴箱(型號(hào) WB22，Made in German)。

1.2 方法

1.2.1 D-半乳糖致衰老小鼠睪丸退行性病變模型的制作及分組 雄性小鼠每日皮下注射予200 mg/kg的D-半乳糖1次，連續(xù)30 d造成衰老模型。將造模小鼠分為模型組、淫羊藿苷高、低劑量組，另加一組正常小鼠為對(duì)照，正常對(duì)照組皮下給予相同體積的生理氯化鈉溶液。造模30 d后，正常組與模型組給予0.5%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)口服。其余兩組分別給予淫羊藿苷(口服，50、100 mg/kg)。藥物混懸于0.5%CMC-Na中，每日給藥1次，連續(xù)20 d。

1.2.2 臟器系數(shù) 處死動(dòng)物，取出睪丸、附睪、精囊腺，精密稱重并計(jì)算臟器指數(shù)(臟器重量/體重量)。

1.2.3 生化檢測(cè) 取血清以放射免疫法檢測(cè)睪酮。取右側(cè)睪丸組織以生理鹽水制成勻漿，檢測(cè) SOD、MDA、LDH、ACP、γ-GT的活性。

1.2.4 組織學(xué)檢測(cè) 取左側(cè)睪丸組織以4%多聚甲醛固定，沿其長(zhǎng)軸垂直于曲細(xì)精管走向剖開(kāi)，經(jīng)石蠟包埋切片，蘇木素-伊紅(HE)染色，于光鏡下觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，數(shù)據(jù)以x±s表示。采用單因素方差分析，并作組間兩兩比較。

2 結(jié)果

2.1 淫羊藿苷對(duì)性腺及附性器官臟器指數(shù)的改善 模型組睪丸臟器系數(shù)較對(duì)照組降低，隨著藥物濃度的增加，接近正常水平，提示淫羊藿苷治療組臟器系數(shù)都有所增大(P＜0.05或0.01)。見(jiàn)表1。

表1 淫羊藿苷對(duì)睪丸臟器系數(shù)的影響(x ± s，n=8)

2.2 淫羊藿苷對(duì)睪丸組織SOD和MDA活性的影響 衰老模型組與對(duì)照組相比，其睪丸SOD顯著降低(P＜0.01)，而MDA含量顯著升高(P＜0.05)，顯示出機(jī)體抗氧化能力下降，而脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物增多。淫羊藿苷組都能不同程度地提高衰老小鼠睪丸SOD活性，同時(shí)降低MDA含量(P＜0.05或0.01)，呈現(xiàn)量效關(guān)系。見(jiàn)表2。

表2 淫羊藿苷對(duì)大鼠睪丸組織SOD和MDA的影響(x ± s，n=8)

2.3 淫羊藿苷對(duì)睪丸特異性酶ACP、γ-GT、LDH活性的影響

造模30 d后，模型組相對(duì)于正常組均下降(P＜0.05或0.01)。高濃度淫羊藿苷治療組ACP、γ-GT、LDH活性相對(duì)于模型組上升41.43%、64.47%、36.14%(P＜0.05或P＜0.01)。見(jiàn)表3。

2.4 淫羊藿苷對(duì)血清睪酮的影響 模型組小鼠血清睪酮水平〔(10.32±1.03)nmol/L〕相比對(duì)照組明顯下降〔(19.57±1.68)nmol/L〕(P ＜ 0.01)，淫 羊 藿 苷 50、100 mg/kg 組〔(13.73±1.22)nmol/L，(15.69±1.04)nmol/L〕有明顯改善(P ＜0.01)。

表3 淫羊藿苷對(duì)特異性酶ACP、γ-GT、LDH活性的影響(x ± s，n=8，U/g)

2.5 淫羊藿苷對(duì)睪丸組織結(jié)構(gòu)的影響 睪丸組織HE染色，于光鏡下觀察。結(jié)果表明:正常組小鼠睪丸各級(jí)生精細(xì)胞豐富，生精細(xì)胞與支持細(xì)胞排列有序;D-半乳糖致衰老模型組睪丸各級(jí)生精細(xì)胞顯著減少，支持細(xì)胞少，甚至成空泡，細(xì)胞排列紊亂。淫羊藿苷低劑量組生精細(xì)胞相對(duì)模型組增多，排列稀疏;淫羊藿苷高劑量組生精細(xì)胞相對(duì)模型組增多，排列較為整齊，與正常組較為接近。見(jiàn)圖1。

圖1 淫羊霍苷對(duì)D-半乳糖模型小鼠睪丸組織結(jié)構(gòu)的作用(HE，×100)

3 討論

D-半乳糖致衰老模型是目前應(yīng)用最多的衰老模型之一，連續(xù)給動(dòng)物注射大劑量D-半乳糖后使機(jī)體細(xì)胞內(nèi)半乳糖濃度升高，在醛糖還原酶的催化下還原成半乳糖醇，其不能被細(xì)胞進(jìn)一步代謝而堆積在細(xì)胞內(nèi)影響正常的滲透壓，從而導(dǎo)致細(xì)胞腫脹和功能障礙，細(xì)胞發(fā)生凋亡，最終致使衰老的發(fā)生〔7〕。全身性的衰老使得下丘腦-垂體-性腺軸(HPG)功能減退〔8〕，睪丸逐步出現(xiàn)退行性病變，睪酮分泌減少，精子數(shù)目減少，性欲減退〔9〕。

睪丸中特異性酶在精子發(fā)生與成熟過(guò)程中也起重要作用。ACP主要位于支持細(xì)胞和精子的溶酶體內(nèi)，其作用是清除受損或衰老細(xì)胞，保持機(jī)體的正常代謝和生理功能，其活力的高低可作為衡量是否有生精障礙的指標(biāo)，LDH促進(jìn)能量代謝及生精上皮的成熟，而γ-GT則為精子的成熟提供酸性環(huán)境〔10〕。本次研究提示淫羊藿苷可以保護(hù)酶的活力，防止各級(jí)生精細(xì)胞，生精上皮的損傷，促進(jìn)生精細(xì)胞能量的生成，從而對(duì)衰老模型小鼠睪丸的病變有保護(hù)作用。

睪酮水平對(duì)精子發(fā)生和成熟有著重要的生理作用，睪丸內(nèi)的睪酮釋放后，被選擇性地輸送到曲細(xì)精管中，與曲細(xì)精管Sertoli細(xì)胞內(nèi)的雄激素受體及管腔中的雄激素結(jié)合蛋白結(jié)合，促使精子發(fā)生和成熟。衰老可以使睪丸逐步出現(xiàn)退行性病變，睪酮分泌減少，本實(shí)驗(yàn)中衰老模型小鼠血清睪酮明顯減少，淫羊藿苷能在一定程度上恢復(fù)睪丸的功能，促進(jìn)睪酮的分泌。另外，氧化應(yīng)激參與了衰老的發(fā)生，本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:模型組的生成酶系MDA過(guò)多，體內(nèi)清除活性氧的酶系SOD降低，說(shuō)明D-半乳糖致衰老模型小鼠睪丸中氧化應(yīng)激狀態(tài)增強(qiáng)，加重了睪丸病變的損傷，而淫羊藿苷顯示具有較好的抗氧化能力。

淫羊藿是傳統(tǒng)的補(bǔ)腎藥，具有補(bǔ)腎壯陽(yáng)、強(qiáng)筋骨、祛風(fēng)濕作用，廣泛用于不孕、不育、性功能障礙以及風(fēng)濕病的治療。淫羊藿苷是淫羊藿主要的有效成分之一，本研究結(jié)果表明:淫羊藿苷對(duì)上述睪丸退行性病變有明顯的改善，其作用呈劑量依賴性。其作用機(jī)制可能與睪丸抗氧化作用及促進(jìn)睪酮分泌有一定的關(guān)系。

1 Seidman SN.Androgens and the aging male〔J〕.Psychopharmacol Bull，2007;40(4):205-18.

2 Ponholzer A，Plas E，Schatzl G，et al.Association of DHEA-Sand estradiol serum levels to symptoms of aging men〔J〕.Aging Male，2002;5(4):233-8.

3 Matsumoto AM，Marck BT，Gruenewal DA.Aging and the neuroendocrine regulation of reproduction and body weight〔J〕.Exp Gerontol，2000;35(9/10):1251-65.

4 馬 淵，張永祥.下丘腦-垂體-性腺軸與衰老〔J〕.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊，2002;26(4):311-3.

5 李 梨，周岐新，石京山.淫羊藿苷藥理作用研究進(jìn)展〔J〕.中國(guó)藥房，2005;16(12):952-4.

6 王正引，張小如，周林瑛，等.補(bǔ)腎健脾養(yǎng)血活血方對(duì)老年小鼠睪丸超微結(jié)構(gòu)的影響〔J〕.中國(guó)醫(yī)藥學(xué)刊，2008;26(2):315-6.

7 崔美芝，劉 浩，李春艷.衰老動(dòng)物模型的建立及評(píng)價(jià)〔J〕.中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志，2006;16(2):118-21.

8 Mastorakos G，Pavlatou MG，Mizamtsidi M.The hypothalamic-pituitaryadrenal and the hypothalamic-pituitary-gonadal axes interplay〔J〕.Pediatr Endocrinol Rev，2006;3(Suppl 1):173-81.

9 Hochreiter WW，Ackermann DK，Brutsch HP.Andropause〔J〕.Ther Umsch，2005;62(12):821-6.

10 Kumar TR，Wiseman AL，Kala G，et al.Reproductive defects in gammaglutamyl transpeptidase-deficient mice〔J〕.Endocrinology，2000;141(11):4270-7.