辛伐他汀對大鼠腦缺血再灌注損傷細胞凋亡的影響

王柏欣 王 昕 邱洪斌 王淑秋 陳 梅 王景濤 徐 輝 陳廷玉

(佳木斯大學，黑龍江 佳木斯 154007)

他汀類藥物是新一代調脂藥，可競爭性抑制膽固醇合成酶系中的關鍵酶羥甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶，使膽固醇合成受到限制。辛伐他汀為半合成他汀類藥物，在缺血性卒中、多發性硬化、Alzheimer病等神經系統疾病中有廣泛神經保護作用〔1～3〕。本實驗采用大鼠局灶性腦缺血模型，觀察辛伐他汀對大鼠腦缺血損傷后細胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 動物分組 健康成年Wistar大鼠，250～300 g，隨機分為四組，空白對照組，假手術組，模型組，辛伐他汀組。模型組和辛伐他汀組都應用線栓法建立大鼠腦缺血再灌注損傷模型，模型組根據再灌注時間分為1，2，3，5，7 d。辛伐他汀組也根據用藥時間再分為用藥 1，2，3，5，7 d。

1.2 試劑 辛伐他汀(浙江京新藥業股份有限公司)，細胞凋亡試劑盒(In situ cell apoptosis Detection kit I，POD)(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 建立腦缺血再灌注模型 根據Longa法〔4〕大腦中動脈栓塞法制備腦缺血再灌注模型。動物稱重，10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)腹腔注射麻醉，將動物仰臥位固定(上門齒、四肢遠端用粗線固定于鼠板上)，碘伏消毒頸部皮膚，頸部正中切口，分離出頸總動脈、頸外動脈以及頸內動脈，分別接扎頸總動脈及頸外動脈，在頸總動脈距離分叉處將尼龍線導入頸內動脈，插入線栓深度約為(18.0±0.5)mm，感到輕微阻力時立即停止插線。此后縫合傷口，留置線頭于體外，30 min后將線拴提至頸總動脈內，完成再灌注。術后將室溫控制在25℃ ～30℃，視動物狀況注射呋塞米或抗生素預防腦水腫和感染。假手術組除進線1.5 mm外，其余相同。辛伐他汀組模型制作成功后，在術后第1天開始給藥。

1.3.2 大鼠神經功能Zea-longa評分〔4〕無神經功能缺失癥狀，活動正常者，計0分;不能完全伸展對側前爪，計1分;動物爬行時出現向右轉圈(追尾現象)，計2分;身體向偏癱側傾倒者，計3分;不能自發行走，意識喪失者，計4分。評分為0分和4分者均被剔除，神經功能評價在取材前進行。

1.3.3 組織切片的制備 各組實驗結束點將動物麻醉，經左心室插管快速灌注生理鹽水約250 ml進行心臟灌洗，用4%多聚甲醛灌洗固定，迅速斷頭取腦，于視交叉后冠狀切取3 mm厚度組織塊，4%多聚甲醛固定，常規脫水，石蠟包埋，切片。HE染色觀察病理形態學改變，神經細胞TUNEL染色法，觀察細胞凋亡情況:切片常規脫蠟入水，按照試劑盒說明書操作，DAB顯色10～30 min，水洗，蘇木素輕度復染，水洗，脫水，透明，封片。光鏡下觀察正常細胞核被染成藍色，凋亡細胞核被染成棕黃色。凋亡細胞計數方法:選取腦皮層部位，200倍光鏡下計數5個視野陽性細胞數目，求其平均值。

1.3.4 電鏡法 各組動物大腦皮層部位腦組織，常規透射電鏡樣品制備(鋨酸后固定2 h，0.1 mmol PBS漂洗，50%、70%、80%、90%、100%、乙醇逐級脫水，純丙酮置換，Epon812包埋，60℃聚合48 h，超薄切片經鈾-鉛雙染)，使用電鏡對大腦皮層腦組織進行觀察。

1.4 統計學方法 計量資料以x±s表示。不同時點間比較采用單因素方差分析。

2 結果

2.1 HE染色結果 空白對照組(即正常組)形態結構未見異常，假手術組染色深，細胞形態和結構無異常。模型組，隨著再灌注時間的不同出現不同程度細胞形態和結構異常，胞體和胞核固縮，深染，核仁不清楚，甚至出現神經元核破裂。辛伐他汀組也出現不同程度細胞形態和結構異常，胞體和胞核固縮甚至核破裂，但是相對于模型組同時間比較數量減少，程度較弱，以3 d最顯著。見圖1。

2.2 電鏡法檢測結果 假手術組腦細胞染色質分布均勻，核膜完整，核孔清晰可見，細胞器結構完好。模型組與假手術組相比線粒體數量減少，部分線粒體嵴減少，板層小體數目減少，排空增多。辛伐他汀組可以減輕此種情況，線粒體呈圓形或卵圓形，嵴較清楚，微絨毛較完整，板層小體結構較完整，僅出現少量的線粒體空泡。見圖2。

2.3 TUNEL法檢測結果 空白對照組(即正常組)未見凋亡細胞，假手術組僅有零星凋亡細胞，模型組與辛伐他汀組各亞組在缺血再灌注1 d后凋亡細胞開始升高，在3 d達到高峰，隨后下降;辛伐他汀組與模型組在相同時間點組間比較，凋亡細胞數量明顯減少，差異有統計學意義(P＜0.05)。以第3天表現最顯著，見表1、圖3。

表1 辛伐他汀對大鼠局部腦缺血再灌注不同時點腦細胞凋亡的影響(x±s，n=6，個/200 倍視野)

圖1 HE染色觀察各組神經細胞病理形態學改變(×200)

圖2 電鏡下觀察各組細胞超微結構

圖3 TUNEL法觀察各組神經細胞凋亡情況(×200)

3 討論

缺血性腦血管病(ICVD)在腦血管病中最為常見，在我國因其具有發病率上升及發病年齡的年輕化趨勢而日益受到醫學界的重視〔5〕。近年的研究表明，細胞凋亡是腦缺血病理作用的重要環節，是造成腦缺血后繼發性損害的重要機制〔5，6〕，腦缺血再灌注后神經細胞損害的分子機制迄今尚未完全被闡明。腦缺血后神經元的死亡主要表現為壞死和凋亡兩種形式。細胞凋亡是在生理和病理條件下的一種主動的死亡方式，受細胞內、外因子調控。在腦缺血再灌注的中心區，由于血液供給急劇減少，細胞能量供給缺乏，ATP耗竭，Na+/K+泵衰竭，導致大多數細胞腫脹，壞死;而在缺血半暗帶區由于有側支循環供血，缺血程度較缺血中心區輕，存在部分能量供應，則細胞損害相對較輕而進展慢;“再灌注損傷”可產生鈣離子失衡，內質網和線粒體功能異常，過氧化作用增強等，這些均可以導致DNA損傷，后者如不能及時修復，積累到一定程度，則可通過啟動凋亡程序，引起細胞凋亡，并隨再灌注時間延長，DNA損傷積累，凋亡細胞亦不斷增加〔7〕。目前認為，凋亡在腦缺血-再灌注損傷的發病機制中發揮著重要作用，并且對梗死的形成過程有著重要的影響。近來的研究表明，辛伐他汀具有多向性神經保護功能〔8〕，能降低腦卒中的發病率并減輕再灌注損傷〔9〕，但其機制尚未明了。神經細胞凋亡是造成缺血-再灌注損傷的重要因素，凋亡神經細胞的多少決定著腦損傷最終范圍的大小〔10〕，因此，防治細胞凋亡是減輕再灌注損傷的重要環節。本實驗結果表明，腦缺血再灌注損傷后出現明顯的細胞凋亡，經過辛伐他汀治療后，細胞凋亡數目和程度明顯降低，說明辛伐他汀具有一定的抑制凋亡的作用，并可能通過抑制神經細胞凋亡而保護大鼠腦缺血再灌注所致的損傷，但其抑制凋亡的機制還有待進一步研究。

1 Amarencto P，Moskowitz MA.The dynamics of statins:from event prevention to neuroprotection〔J〕.Stroke，2006;37:294-6.

2 Youssef S，Stuve O，Patarroyo JC，et al.The HMG-CoA reductase inhibitor，atorvastatin，promotes a thbias and reverses paralysis in central nervous system autoimmune disease〔J〕.Nature，2002;420:78-84.

3 Eekert GP，Wood WG，Muller WE.Statins:drugs for Alzheimer's disease〔J〕.Neurol Transm，2005;112:1057-71.

4 Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniotomy in rats〔J〕.Stroke，1989;20(1):84-91.

5 Wang P，Wang W，Xuy L，et al.Comparison of focal cerebral ischemia/reperfusion induced apoptosis of astrocytes and neurons in rats〔J〕.Chin J Histochem Cytochem，2006;16(2):113-8.

6 Kalinichenko SG，Matveeva NI.Morphological characteristic of apoptosis and its significance in neurogenesis〔J〕.Neurosci Behav Physiol，2008;38(4):333-44.

7 Nagayama T，Lan J，Henshall DC，et al.Induction of oxidative DNA damage in the peri-infarct region after permanent focal cerebral ischemia〔J〕.J Neuroehem，2000;75(4):1716-28.

8 謝 坤，李 勇.他汀類藥物的多效性研究〔J〕.世界臨床藥物，2005;26:589-91.

9 Tobert JA.Lovastatin and beyond:the history of the HMG-CoA reductase inhibitors〔J〕.Nat Rev Drug Discov，2003;2:517-26.

10 李小剛，朱 克，李 楠，等.谷氨酸對神經細胞鈣離子內流和凋亡的影響及谷氨酸受體拮抗劑保護作用的研究〔J〕.中華老年心腦血管疾病雜志，2001;3:122-5.