辛伐他汀對冠心病患者主動脈MMP-2和MMP-9的影響

馮增斌 劉志偉 肖 鋒 胡建功 房大廣

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院心臟外科，河北 承德 067000)

動脈粥樣硬化不穩(wěn)定斑塊破裂是急性冠脈綜合征發(fā)生的主要原因?；|(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)家族中的MMP-2、MMP-9可導(dǎo)致斑塊纖維帽基質(zhì)的降解使得斑塊易于破裂而導(dǎo)致急性冠脈綜合征的發(fā)生〔1〕。辛伐他汀可降低大鼠、家兔主動脈組織內(nèi)MMP-2，MMP-9的含量及表達(dá)〔2〕，對于人類臨床研究文獻(xiàn)較少。本試驗旨在研究冠心病行冠狀動脈移植術(shù)患者應(yīng)用辛伐他汀后主動脈組織及血清內(nèi)MMP-2、MMP-9含量的變化，探討藥物干預(yù)的可能機(jī)制，給臨床用藥提供依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 研究對象 我院自2007年2月至2009年9月行冠狀動脈旁路移植術(shù)患者46例，均行冠脈造影檢查證實有三支冠狀動脈狹窄或左主干病變，具備手術(shù)指征。近期無發(fā)熱、感染、合并免疫性疾病、腫瘤及肝、腎功能異常。術(shù)前全部服用硝酸異山梨醇酯、貝他樂克、阿司匹林等藥物，并皮下注射低分子肝素。其中27例服用辛伐他汀4 w以上，20 mg/d，睡前服用，此組為治療組。另有19例患者未進(jìn)行降脂治療，未服用過他汀類藥物，為對照組。治療組男16例、女11例，年齡46～68〔平均(56±9)〕歲，10例有心肌梗死病史，5例合并室壁瘤，15例血甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDLC)、極低密度脂蛋白膽固醇(VLDL-C)、載脂蛋白B(ApoB)全部正常，12例有不同程度升高。對照組男13例、女6例，年齡50～65〔平均(57±5)〕歲，均無心肌梗死病史及室壁瘤，查血脂5例全部正常，14例有不同程度升高。

1.2 試劑 辛伐他汀(商品名舒降之)由杭州默沙東公司提供。MMP-2，MMP-9試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司的雙抗體夾心酶聯(lián)免疫試劑盒。MMP-2，MMP-9鼠抗人單克隆抗體購于武漢博士德公司。

1.3 標(biāo)本采集 兩組患者經(jīng)禁食12 h后，分別于術(shù)前經(jīng)置入的頸靜脈插管抽取靜脈血4 ml，置于干燥玻璃試管中，室溫靜置30 min后3 000 r/min離心15 min，分離血清，統(tǒng)一編號，－70℃冰箱保存。術(shù)中除乳內(nèi)動脈與前降支吻合，其余血管橋均使用大隱靜脈。兩組患者采用靜脈橋(1.8±0.5)支。選擇升主動脈前壁打孔并與靜脈橋近端吻合。留取打孔器圓刃切下的主動脈組織石蠟包埋。

1.4 血清MMP-2、MMP-9的測定 采用酶聯(lián)免疫法(ELISA)測定。抗人多克隆抗體MMP-2(一抗)預(yù)先包被于酶標(biāo)板上，分別加入標(biāo)準(zhǔn)液和待測血清樣本。MMP-2與一抗特異性結(jié)合。加入生物素化的抗人MMP-2(二抗)，與在單抗上的人MMP-2結(jié)合而形成免疫復(fù)合物，未結(jié)合的被洗去。辣根過氧化物酶標(biāo)記的Streptavidin與二抗的生物素結(jié)合，多余的物質(zhì)被洗掉。加入四甲基聯(lián)苯胺(TMB)染色。最后加入終止液。置酶標(biāo)分析儀中測量OD值。MMP-9測定同上。

1.5 主動脈組織MMP-2、MMP-9表達(dá)的測定 用鏈霉親合素-生物素-過氧化物酶(SABC)法染色。以胞漿或胞膜呈均一棕黃色顆粒為陽性，無棕黃色顆粒者為陰性。方法及試劑:石蠟標(biāo)本4μm連續(xù)切片，脫蠟至水。免疫組織化學(xué)染色按說明書指示進(jìn)行;H2O2室溫滅活過氧化物酶，胰蛋白酶消化，檸檬酸微波修復(fù)。正常羊血清室溫封閉非特異抗原位點，滴加一抗(鼠抗人MMP-2單克隆抗體1∶50，鼠抗人MMP-9單克隆抗體1∶50)，37℃孵育2 h，滴加 SABC 復(fù)合物(1∶200)37℃ 20 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)染色，蘇木精復(fù)染，脫水，透明，封片。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件，數(shù)據(jù)用x±s表示，計數(shù)資料比較采用χ2檢驗，計量資料比較采用t檢驗。

2 結(jié)果

辛伐他汀組患者血清內(nèi)MMP-2、MMP-9的含量明顯低于對照組(P＜0.01)。辛伐他汀組患者主動脈組織MMP-2〔10(27.0%)vs 11(57.9%)〕、MMP-9〔8(29.6%)vs 13(68.4%)〕的陽性表達(dá)明顯低于對照組(P＜0.01)。見表1，圖1，圖 2。

表1 兩組患者血清內(nèi)MMP-2、MMP-9的含量(x±s)

圖1 主動脈組織MMP-2表達(dá)(×200)

圖2 主動脈組織MMP-9表達(dá)(×200)

3 討論

MMPs家族成員有20多種，其中MMP-2，MMP-9是血管壁細(xì)胞表達(dá)和分泌的最主要的MMP，在內(nèi)膜損傷和粥樣病變形成的過程中起關(guān)鍵作用。故有作者認(rèn)為血清MMPs水平能反映動脈硬化的病變程度〔3〕。動物試驗證實，MMP-2，MMP-9在高膽固醇兔動脈損傷的早期即有表達(dá)，在不穩(wěn)定斑塊中顯著表達(dá)〔4〕。在炎性因子啟動下，粥樣斑塊內(nèi)高濃度浸潤的巨噬細(xì)胞可釋放大量MMPs。Brown〔1〕等對冠心病患者經(jīng)介入治療，旋切下的動脈粥樣硬化斑塊的MMP-2，MMP-9檢測表明，不穩(wěn)定心絞痛患者其表達(dá)水平顯著高于穩(wěn)定心絞痛患者。

近年許多關(guān)于他汀類藥物的臨床試驗結(jié)果表明，該類藥物可以明顯減緩冠心病患者動脈硬化病變的進(jìn)展，且具有獨(dú)立其降脂作用外的穩(wěn)定斑塊的作用，他汀類藥物能夠降低急性冠脈綜合征患者血清MMPs水平。2000年，Ikeda〔5〕等報道氟伐他汀能夠抑制人血管內(nèi)皮細(xì)胞的MMP-1表達(dá)。這些研究均從他汀類藥物對細(xì)胞的直接作用觀察該類藥物對細(xì)胞MMPs表達(dá)的影響，并得出較肯定的結(jié)論。他汀類藥物抑制MMPs表達(dá)的機(jī)制尚不清楚，根據(jù)Yang等〔6〕的研究，可能與細(xì)胞外MMPs引導(dǎo)物(EMMPRN)有關(guān)。EMMPRN在人類單核/巨噬細(xì)胞中表達(dá)，并通過非膽固醇依賴的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)，在MMPs合成前48 h的活性作用達(dá)到高峰。EMMPRN在MMPs的合成中起著重要作用，他汀類藥物則可通過抑制EMMPRN轉(zhuǎn)錄因子從而抑制EMMPRN的基因表達(dá)，導(dǎo)致MMPs的合成受到抑制。

本試驗結(jié)果提示辛伐他汀通過減少主動脈組織MMP-2，MMP-9的表達(dá)，從而減少細(xì)胞外基質(zhì)成分降解，減輕血管損傷，延緩動脈粥樣硬化病變，減少急性心血管事件。提示降低MMP-2，MMP-9表達(dá)水平可能是辛伐他汀抗動脈粥樣硬化機(jī)制之一。

1 Brown DL，Desai KK，Vakili BA，et al.Clinical and biochemical results of the metalloproteinase inhibition with subantimicrobial doses of doxycycline to prevent acute coronary syndromes(MIDAS)pilot trial〔J〕.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2004;24(4):733-8.

2 Loftus IM，Thompson MM.The role of matrix metalloproteinases in vascular disease〔J〕.Vasc Med，2002;7(2):117-33.

3 Huang CY，Wu TC，Lin WT，et al.Effects of simvastatin withdrawal on serum matrix metalloproteinases in hypercholesterolaemic patients〔J〕.Eur J Clin Invest，2006;36(2):76-84.

4 Freestone T，Turner RJ，Higman DJ，et al.Influence of hypercholesterolemia and adventitial inflammation on the development of aortic aneurysm in rabbits〔J〕.Arterioscler Thromb Vasc Biol，1997;17(1):10-7.

5 Ikeda U，Shimpo M，Ohki R，et al.Fluvastatin inhibits matrix metalloproteinase-1 expression in human vascular endothelial cells〔J〕.Hypertension，2000;36(3):325-9.

6 Yang JM，Xu Z，Wu H，et al.Overexpression of extracellular matrix metalloproteinase inducer in multidrug resistant cancer cells〔J〕.Mol Cancer Res，2003;1(6):420-7.