匹伐他汀抑制實驗性肺纖維化大鼠MMP-9和TIMP-1表達

謝莉 何振華 譚小武

肺纖維化(pulmonary fibrosis，PF)是一種以肺間質損害和纖維化為病理學特征的彌漫性肺間質性疾病[1]。其病因不明，但危害嚴重，一般而言，本病確診后平均生存期約3～5年，5年生存率僅30%～50%[2-3]。近年研究表明，基質金屬蛋白酶(MMPs)及其抑制劑(TIMPs)在細胞外基質的降解與重塑過程中發揮重要作用[4-5]。在本研究當中，我們擬建立大鼠肺纖維化模型，探索匹伐他汀對博來霉素致大鼠肺纖維化中干MMP-9和TIMP-1表達的影響，以進一步明確其抗纖維化作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

博來霉素為日本化藥株式會社產品（批號740104），匹伐他汀為廣東東陽光藥業有限公司產品(純度：95.6%，批號：0703001）。SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、ECL發光試劑盒購自江蘇碧云天生物技術有限公司。MMP-9單克隆抗體購自Santa Cruz。TIMP-1多克隆抗體為武漢博士德生物工程有限公司產品。HRP標記羊抗鼠多克隆抗體購自北京博奧森生物技術有限公司。堿性磷酸酶顯色劑購自普洛麥格。

1.2 實驗分組與動物模型的建立

54只健康大鼠雄性SD大鼠隨機分為模型組、陰性對照組以及匹伐他汀組，各18只。將大鼠仰臥固定于操作臺上，經10%水合氯醛腹腔注射麻醉(2.5mL/kg)后，頸部消毒，分離暴露氣管，注射器經氣管軟骨環間隙朝向心端刺入氣管并緩慢注入0.3mL博萊霉素生理鹽水溶液(5mg/kg)或生理鹽水溶液，注后立即將動物直立并左右旋轉，使藥液在肺內均勻分布。對照組注入等體積的生理鹽水。

1.3 標本的采集與處理

在造模2、4、6周進行取材（腹腔動脈放血法處死實驗大鼠），每次各組隨機處死6只。取右肺組織切成小塊存于無菌EP管中，同時獲取肺泡灌洗液（BALF）置于-80℃凍存以用于下一步研究。

1.4 Western blot檢測MMP-9和TIMP-1的表達

按試劑盒說明提取上述肺組織蛋白并進行SDS-PAGE電泳。結束后按照半干轉印法將蛋白轉印到硝酸纖維素膜上，用含5%脫脂牛奶的TBS溶液室溫封閉2h，PBST洗滌后與抗HO-1抗體于4℃孵育過夜。最后與HRP標記的羊抗鼠IgG二抗室溫孵育2h。暗室發光顯影，灰度掃描。

1.5 ELISA檢測肺泡灌洗液中MMP-9以及TIMP-1的產生

獲取肺泡灌洗液，并按照試劑盒說明書提前15min配制好工作液。操作步驟按照試劑盒提供的方法進行。包括繪制標準曲線，加入樣品，洗滌，顯色等步驟。最后于波長450nm下用酶標儀測定其OD值。

1.6 統計學方法

2 結果

2.1 肺泡灌洗液中MMP-9，TIMP-1濃度

肺泡灌洗液中MMP-9，TIMP-1濃度見表1所示。在模型組中，MMP-9濃度在第2周水平最高，隨后開始下降，但第6周水平依然高于陰性對照組。匹伐他汀處理后，MMP-9濃度均低于同期模型組，但同樣也高于對照組。TIMP-1的產生情況與MMP-9類似。見表2。

表1 各研究組大鼠BALF中MMP-9濃度（ng/ml）

表2 各研究組大鼠BALF中TIMP-1濃度（ng/ml）

2.2 MMP-9和TIMP-1蛋白表達情況

與對照組相比，博萊霉素模型組在第2周時MMP-9和TIMP-1蛋白表達明顯增高。4周后，MMP-9表達水平有所減少，但TIMP-1依然呈高水平表達，直到第6周才略有降低。匹伐他汀處理組MMP-9和TIMP-1均低于模型組水平。見圖1，圖2。

圖1 各組MMP-9表達情況 圖2 各組TIMP-1表達情況

3 討論

肺纖維化的發生是一個非常復雜的病理生理過程，盡管病因各異，但肺組織中的基質代謝異常是本病中的共同特征，在此過程中，MMPs及其抑制劑TIMPs在細胞外基質的講解與重塑過程中發揮至關重要作用[5]。任何能引起其合成和降解異常的因素都可以引起細胞外基質聚集，最終導致肺纖維化的形成。博萊霉素是用于建立纖維化模型的理想藥物。在早期誘導的纖維化過程中，由于博萊霉素所誘發的炎癥反應促進免疫細胞合成和釋放一系列炎癥細胞因子，從而引起MMPs的合成與活化。因此這時期尚未出現細胞外基質堆積。在繼發性修復階段，MMPs的活性有所降低，而TIMP-1表達仍維持在較高水平，引發了MMP-9/TIMP-1的比例失衡，從而引起纖維化的發生[6-7]。我們的研究結果也顯示，模型組在2～6周內，隨著時間延長，MMP-9含量逐漸降低，而6w時TIMP-1依然表達持續升高，與上述理論相符。

匹伐他汀是第一個全合成的HMG-CoA還原酶抑制劑，是一類降脂藥物[8]。近年的研究顯示，他汀類藥物能可通過抑制MMPs活性、抑制成纖維細胞增殖以及膠原合成、調節細胞外基質的降解，因此可能具有抗纖維化的作用[9]。但直接進行動物實驗并觀察其抗肺纖維化方面的研究并不多。在本研究當中，我們通過動態觀察結果顯示，匹伐他汀處理后，博萊霉素所致的肺纖維化在2周、4周和6周時，匹伐他汀均表現出明顯的降低MMP-9及TIMP-1的作用，尤其以第4周（肺纖維化形成期）MMP-9的降低作用尤為明顯。這可能是匹伐他汀減輕基底膜損傷、減輕肺泡炎性滲出的重要機制。6周后，肺內主要病理生理改變為肺纖維化，而匹伐他汀在此時期依然能降低MMP-9的水平，同時也能降低TIMP-1的表達水平，使MMPs/TIMPs趨于平衡，最終延緩/抑制纖維化的發生發展。綜上所述，匹伐他汀能降低肺纖維化大鼠模型中MMP-9和TIMP-1水平，因此有望成為治療本病的輔助用藥。

[1]Lee JS, McLaughlin S, Collard HR. Comprehensive care of the patient with idiopathic pulmonary fibrosis[J]. Curr Opin Pulm Med, 2011.

[2]Todd NW, Atamas SP. Survival in pulmonary fibrosis combined with emphysema: likely defined by characteristics of specific patient subpopulations[J]. Fibrogenesis Tissue Repair, 2011,4(1):17.

[3]陳佰義.特發性肺纖維化診斷和治療的若干問題[J].當代醫學,2001(07):42-45.

[4]Manni ML, Czajka CA, Oury TD, et al. Extracellular Matrix Powder Protects Against Bleomycin-Induced Pulmonary Fibrosis[J]. Tissue Eng Part A, 2011.

[5]Dancer RC, Wood AM, Thickett DR. Metalloproteinases in idiopathic pulmonary fibrosis[J]. Eur Respir J, 2011.

[6]Patel RB, Kotha SR, Sherwani SI, et al. Pulmonary fibrosis inducer, bleomycin, causes redox-sensitive activation of phospholipase D and cytotoxicity through formation of bioactive lipid signal mediator,phosphatidic acid, in lung microvascular endothelial cells[J]. Int J Toxicol,2011,30(1):69-90.

[7]Degryse AL, Lawson WE. Progress toward improving animal models for idiopathic pulmonary fibrosis[J]. Am J Med Sci, 2011,341(6):444-449.

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[9]Kim JW, Rhee CK, Kim TJ, et al. Effect of pravastatin on bleomycin-induced acute lung injury and pulmonary fibrosis[J]. Clin Exp Pharmacol Physiol, 2010,37(11):1055-1063.