NGAL在乳腺癌中的表達及意義

王曉鴻 郭永誼 茍新敏

NGAL(neutrophil gelatinase associated lipocalin，NGAL)是Lipocalin家族的新成員，于1993年在人中性粒細胞中被發現和分離出來[1]。近年來NGAL與人類腫瘤的關系受到了人們的重視，并在NGAL基因的功能以及NGAL在人體正常和腫瘤組織中的表達特征方面取得了一些有意義的進展。本研究采用免疫組織化學方法檢測60例乳腺癌中NGAL蛋白的表達水平，探討其在乳腺癌中的表達特點及其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2003～2010年在中山大學附屬第五醫院行初次手術且有完整臨床病理資料存檔的乳腺癌組織石蠟標本60例(術前均未行化療、放療或生物治療)，中位年齡55歲(36～69歲)。病理分級:G114例，G214例，G332例。病理類型:導管癌28例，小葉癌21例，其他類型11例。手術病理分期:Ⅰ期14例，Ⅱ期11例，Ⅲ期22例，Ⅳ期13例。淋巴結轉移:有轉移24例，無轉移36例。正常乳腺組織10例，為同期因其他良性疾病手術切除的卵巢組織，中位年齡43歲(31～58歲)。以已知胰腺癌陽性片作陽性對照，以PBS代替一抗作陰性對照。所有標本均經HE染色證實診斷。

1.2 主要試劑及檢測方法 鼠抗人NGAL單克隆抗體購于美國R＆D公司，免疫組織化學試劑盒、DAB顯色試劑盒均購自福州邁新公司。采用免疫組織化學二步法，石蠟切片逐級脫蠟至水，抗原修復，3%H2O2封閉內源性過氧化物酶10 min。PBS沖洗，滴加一抗，37℃孵育2 h，PBS洗 3次，5 min/次。滴加二抗，37℃孵育30 min，PBS沖洗3次，5 min/次。DAB顯色，自來水沖洗，蘇木素復染，脫水透明，封片，光鏡觀察。

1.3 結果判定 采用IP(intensity+percentages)評分方法，綜合考慮染色強度和陽性細胞數，由兩位病理學專家獨立閱片，再討論確定免疫組織化學結果。①染色強度計分，細胞漿無染色:0分;淡黃色:1分;棕黃色:2分;棕褐色:3分。②陽性細胞數計分。細胞漿無染色:0分;染色細胞數＜1%:1分;染色細胞數1% ～10%:2分;染色細胞數10% ～33%:3分;染色細胞數33% ～66%:4分;染色細胞數＞66%:5分。兩項之和即為總分。陰性(-):＜2分;陽性(+)～(+++):2～8分;低表達(+):2～4分;中等表達(++):5～6分;高表達(+++):7～8分。

1.4 統計學方法 所有數據采用SPSS 13.0軟件包處理。樣本率的比較用χ2檢驗及Fisher確切概率檢驗，所有的統計分析均分雙側檢驗。

2 結果

2.1 NGAL在不同性質的乳腺組織中的表達 通過免疫組化檢測，可見NGAL的表達定位于上皮細胞胞漿中。正常上皮中，只有2例可見NGAL微弱的表達，并且表達位于細胞漿內靠近細胞膜的局限區域，表達率為10%。60例乳腺癌組織中49例NGAL表達陽性，表達率為81.7%，多為中、高表達(++)～(+++);NGAL的陽性表達率在乳腺癌和正常卵巢組織中比較，差異有統計學意義(P＜0.05)。

2.2 NGAL表達與乳腺癌臨床病理指標的關系 NGAL蛋白表達與乳腺癌分化程度、病理類型、臨床病理分期、淋巴結轉移有關。NGAL蛋白在分化程度高(G1～G2)的腫瘤中陽性表達率為67.9%，在分化程度低(G3)的腫瘤中陽性表達率為93.8%，差異有統計學意義(P＜0.05)。NGAL在導管型乳腺癌的陽性表達率為96.4%，在小葉型乳腺癌的表達率為90.5%，在其他類型乳腺癌中的表達率為90.9%，各種類型間無明顯差異(P＞0.05)。NGAL蛋白在乳腺癌早期(Ⅰ～Ⅱ)期腫瘤中陽性表達率為68.0%，在晚期(Ⅲ～Ⅳ)腫瘤中陽性表達率為91.4%，差異有統計學意義(P＜0.05)。NGAL蛋白在有淋巴結轉移的乳腺癌組織中陽性表達率為91.7%，在無淋巴結轉移的乳腺癌組織中陽性表達率為66.7%，差異有統計學意義(P＜0.05)(表1)。

表1 不同臨床病理指標的卵巢癌組織中NGAL蛋白的表達

3 討論

Lipocalin是一個有20多種可溶性蛋白組成的大家族。蛋白質晶體結構分析證實，它們均擁有一個高度保守的由8條反向平行的β折疊形成的桶狀親脂性三級結構，其可結合疏水性的小分子形成復合物，也可與某些細胞膜受體結合[2]，在人體內物質轉運，免疫調節等方面發揮著重要作用。NGAL作為Lipocalin家族的一員，其氨基酸序列及DNA內含子和外顯子的排列與本家族其他成員有很高的保守性和同源性。這個獨特的結構讓該家族成員有能力結合一些主要是疏水性的小分子物質而形成復合物，甚至還可以在細胞表面結合特異性受體[3]。在親脂性小分子物質的轉運中發揮作用，更在細胞內環境穩定或免疫調節中扮演重要角色。除中性粒細胞外，正常情況下NGAL蛋白亦可微量表達與腔道表面組織細胞，如呼吸系統的肺泡間巨噬細胞、支氣管上皮單個黏液細胞和消化系統的胃壁細胞、小腸部分潘氏細胞、肝膽管細胞、胰小葉內和閏管細胞以及泌尿生殖系統的腎近曲小管細胞、尿道傘部細胞、前列腺上皮細胞等[4]。而在病理狀態下，其表達程度明顯增強。最初學者認為NGAL可誘導中性粒細胞內顆粒釋放，在抗感染中發揮重要作用[5-7]。最近進一步研究通過NGAL在大鼠小鼠中的同源基因研究證實，NGAL蛋白可能為一種新的癌基因，在許多腫瘤中表達上調[8]。Stoesz等于1998年就研究發現，NGAL在乳腺癌組織細胞中表達。在大鼠NGAL的同系物NRL被確定為在HER-2/neu癌蛋白所誘導的乳腺癌發生過程中是唯一表達上調的蛋白，可能是介導大鼠乳腺癌發生的重要分子靶標。Yang等[8]研究發現，在乳腺癌中NGAL/Lipocanlin2的高表達可能在調節腫瘤的浸潤與轉移中具有重要作用，而通過基因沉默降低NGAL的蛋白水平則能阻止腫瘤細胞的轉移。Berger等[9]證實，Lipocanlin2/NGAL基因敲除后，乳腺癌的發生、腫瘤的增殖程度均明顯降低，但由此引起的肺轉移并未受到影響。另有學者發現，NGAL蛋白的表達水平與乳腺癌腫瘤細胞的S期分數和增殖指數Ki67呈正相關[10]。本研究顯示，NGAL蛋白在乳腺癌中顯著表達，與正常乳腺組織比較差異具有統計學意義。另外，NGAL在乳腺癌中的表達與腫瘤的分化程度和手術病理類型、分期及淋巴結轉移率相關。提示NGAL不僅可以用于腫瘤發生的早期預測，而且在腫瘤的進展、浸潤和轉移中具有一定作用，但其作用機制目前尚未明確。而Bauer等在乳腺癌中發現，NGAL的表達與癌細胞的淋巴結轉移、不良的組織學分級、HER-2/neu過表達以及類固醇激素受體陰性等高度相關[10]。NGAL可以與鐵高親和力結合，介導鐵的轉運，上調鐵易感基因的表達，促進腫瘤細胞的增殖[11-12]。而Shi等用RT-PCR對鼠的乳腺癌細胞株4T1研究發現NGAL不能影響癌細胞的增殖，但能明顯促進癌細胞的浸潤與轉移。而在食管癌的研究中發現，反義封閉NGAL基因表達后，接種裸鼠的癌細胞侵襲能力明顯降低[13]。Yang等證明，NGAL能夠通過激活ERalpha/Slug信號通路，調節vimentin/fibronectin和E-cadherin的表達及活性，誘導EMT(epithelial tomesenchymal transition)發生，促進乳腺癌細胞侵襲及轉移[14]。Fernandez等研究發現NGAL可能通過保護并調節MMP-9的表達及活性而促進腫瘤生長和轉移。

乳腺癌是女性腫瘤中的一種多發病，且有高度的家族遺傳性，對該病的早期診斷、檢測及干預具有非常重要的意義。本研究證實，NGAL可作為乳腺癌發生、進展、浸潤及侵襲等發生發展過程中一個重要的檢測指標及靶點，是評估腫瘤生物學特性和預后的一個新的參考指標。在篩選高危患者，指導臨床制定合理治療方案等方面具有積極的意義。

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