東鄉縣城污水中耐熱大腸菌群的耐藥性檢測與分析

李仁道，何金德

(1、江西省東鄉縣疾病預防控制中心，江西 東鄉 331800；2、江西省東鄉縣環境監測站，江西 東鄉 331800)

抗生素在人和動物中的濫用所導致的微生物抗生素耐藥性在國內外臨床醫學和畜牧獸醫學研究領域一直受到高度重視，而其對生態環境所造成的負面效應還鮮為人知。隨著抗生素的大量使用，部分沒有被代謝掉的抗生素會隨人和動物的排泄作用而不斷進入環境，從而使得環境中的微生物長期處于低濃度抗生素的訓化狀態中，經過一定時間后也有可能逐漸產生耐藥性。微生物耐藥性產生的機理之一就是耐藥基因的形成，比如抗性基粒。一旦產生這種基因，就有可能會引起更廣泛的傳播。歐盟各國學者最近的研究結果表明，環境中抗生素微量污染及抗生素耐藥性細菌的存在和傳播不容忽視[1，2]。

水環境中耐熱大腸菌群的抗生素耐藥性具有尤其重要的衛生學意義：水中耐藥菌及其耐藥因子能通過飲水或游泳等途徑進入人體腸道進而將耐藥性轉移腸道寄居的細菌獲得性耐藥[3]。

進入污水處理廠的污水主要是居民的生活污水，也包含有醫院排放的污水，抗生素殘留的可能性很大。本研究從江西省東鄉縣污水處理廠二沉池中采集水樣分離出耐熱大腸群菌，并采用藥敏試紙擴散法選用了15種目前臨床上常用的抗生素，進行了抗藥性的初步研究。

1 材料與方法

1.1 水樣 東鄉縣污水處理廠始建于2009年，是一座現代化城市污水集中處理廠，污水主要來自縣城區域的居民生活污水及兩家縣級醫院排放的污水。平均日處理污水2.5～3萬m3。本研究于2011年4月采取污水處理廠的二沉池的水樣，用經滅菌的玻璃瓶裝回實驗室。

1.2 耐熱大腸菌群的分離 耐熱大腸菌群又稱糞大腸菌群，是一類通常寄居于人和溫血動物腸道,在44.5℃生長良好并發酵乳糖產酸產氣、需氧及兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽胞桿菌，主要包括大腸埃希桿菌(E.coli)、克雷伯菌屬(Klebsiella)、腸桿菌屬(Enterobacter)、沙雷菌屬(Serratia)和檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)。在受到糞便污染的水體中，此菌群與腸道致病菌具有相似的適應性和敏感性，存在時間大致相同，因此在水質監測中被用作糞便污染的優良指示菌[4]。

本實驗參照美國《水和廢水標準檢驗方法》[5]中的濾膜法在4h內對水樣中的耐熱大腸菌群進行檢測分離。10ml水樣加入90ml無菌生理鹽水中充分混勻。用口徑為47mm、孔徑0.45μl的微孔濾膜過濾。濾膜細菌截留面向上，以滾動方式置于經改良的m-FC平板(以甲基藍替換苯胺藍)上，排除光滑面與平板表面的氣泡。于37℃進行5h復蘇培養后轉至44.5℃培養19h。

對濾膜上典型藍色菌落數為20～60的平板上菌落進行計數,計算耐熱大腸菌群平均密度。用無菌接種針挑取各類形態的藍色菌落50個，用LB培養基平板劃線接種純化，純化菌株接種于半固體培養基37℃培養24小時后保存備用。

1.3 耐藥性測定 采用紙片擴散法 (Kirby-Bauer法)[6]，按照臨床實驗室標準化協會(CLSI)的抗微生物藥物敏感試驗執行標準[7]判斷結果。

1.4 質控菌株 大腸埃希菌ATCC25922。

2 結果

2.1 耐熱大腸菌群檢測結果 污水耐熱大腸菌群平均密度為為 9.2×102CFU/100ml。

2.2 藥敏試驗結果 50株耐熱大腸菌群除對對亞胺培南全部敏感外，對其余14種抗生素均表現了不同程度的耐藥，其中對氨芐西林耐藥率最高為78%。具體耐藥情況見表1。

3 討論

表2 耐熱大腸菌群對常用抗生素藥物的耐藥率

本研究實驗結果表明，污水環境中耐熱大腸菌群對常用抗生素存在一定程度的耐藥性。與劉小云等通過水環境中耐熱大腸菌群對10種常用抗生素的藥物敏感性試驗，表明水環境微生耐藥性普遍存在的結論基本相符[8]。

在本實驗中，分離出的耐熱大腸菌群的耐藥率由高到低分別為氨芐西林、四環素、環丙沙星、頭孢他啶、左氧氟沙星、頭孢曲松、頭孢噻肟、頭孢噻吩、哌拉西林、阿米卡星、頭孢西丁、慶大霉素、阿莫西林/克拉維酸、氨曲南、亞胺培南，其中β-內酰胺類(包括青霉素類、頭孢菌素類)的氨芐西林耐藥率78%、頭孢他啶耐藥率為32%、頭孢曲松耐藥率28%、頭孢噻肟耐藥率26%、頭孢噻吩耐藥率為24%、頭孢西丁耐藥率20%、阿莫西林/克拉維酸17%。與常曉松等對醫院污水污染水環境中耐熱大腸菌群氨芐西林耐藥率80.0%、頭孢噻肟耐藥率25.0﹪實驗結果基本一致[9]。青霉素類、頭孢菌素類是目前臨床應用最為廣泛的抗菌素，其在臨床的大量應用導致針對此類抗菌素的耐藥率升高，并占主導地位[9]。水環境中的耐熱大腸菌群對青霉素類抗菌素產生這么高的耐藥率，說明青霉素類抗菌素的濫用已經非常嚴重，不僅增加了臨床耐藥性傳播的機率，而且導致了排放水環境中相應抗菌素耐藥率的顯著升高。水環境微生物耐藥性形成的原因可能有：人和動物體內耐藥菌及耐藥因子向水環境的擴散，水環境中低濃度的抗生素對菌群產生的耐藥性選擇壓力[2]。雖然其機機制并未確定，但水環境微生物耐藥極有可能是公共衛生和生態環境的一大隱患。耐藥微生物及耐藥因子可經多途徑侵入人體，將耐藥性傳遞給體內致病菌，加大臨床中感染性疾病的治療難度[10-12]。

耐藥性是微生物對抗菌藥物的相對抗性，是細菌等微生物受到抗生素的選擇性壓力的反應，是微生物進化過程的自然規律，也是微生物耐藥基因長期進化的必然結果。由于抗生藥物殺死了敏感菌群，而對耐藥菌的存活和繁殖無效，所以耐藥性是過度使用和濫用抗菌藥的必然后果。因此，人們應該嚴格控制抗生素的預防使用和非醫療中農、林、牧、副、漁以及飼料的抗生素使用，醫療機構應積極加強耐藥監測，合理、規范選用抗菌藥物，才能控制耐藥菌株的出現與傳播。

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