啟東肝癌高發區隊列樣本庫的建立與應用

陳建國，王金兵，陸建華，張永輝，陳陶陽

啟東是我國的肝癌高發區，自 1972年以來，啟東現場采用流行病學、臨床及實驗室等方法，對肝癌的病因、肝癌的診斷和肝癌的治療等進行了廣泛的研究[1]。通過采集并分析大量血樣、尿樣及其他標本，為肝癌的實驗研究提供了醫學和生物學證據。20 世紀 80年代末嘗試建立生物標本庫，為啟東肝癌研究的持續和深入發展增加了競爭力。現把我所生物樣本庫的建立與應用做一總結。

1 樣本的種類及保留方法

1.1 樣本種類

1.1.1 血樣 ①血清：未抗凝的血標本經離心后獲得，即血漿中除去纖維蛋白后的淡黃色膠狀液體。20 世紀 80年代用注射器采集外周靜脈血 5 ml 注入玻璃試管；90年代逐步采用真空采血管采集外周靜脈血 5～10 ml，室溫直立靜置 30min（現場采血室溫放置時間控制在 6 h 以內），室溫，1000×g 水平離心 15min。用一次性移液管小心吸取上層血清，根據實驗需要的量分裝到 1.5 ml 的凍存管后分別保存。②血漿：抗凝的血標本經離心后獲得，即血液中除血細胞、血小板之外的部分。抗凝劑可用肝素、EDTA-K3或EDTA-K2等。采用不同規格（6～10 ml）的真空采血管采集外周靜脈血，立即輕輕顛倒震搖 8～10 次，室溫直立靜置 30min（現場采血室溫放置時間控制在 6 h 以內）。實驗室分離前再次輕輕顛倒混勻 8～10 次，室溫水平離心1500×g，20min。用一次性移液管依次小心吸取上層血漿，根據實驗需要量分裝到 1.5 ml 的凍存管。③白細胞：全血中的一種細胞成分。抗凝采血管離心分離后，上層為血漿、中間層即為白細胞（WBC）（下層為紅細胞）。–80℃保存。

1.1.2 尿樣 分為晨尿、夜尿或 24 h 尿樣，根據項目設計和需要，選用不同規格的采樣容器分別采集尿液，并記錄總量，做常規檢測及（或）特殊檢查。每一人份的尿樣以Fisher 錐形管保留，選用不同規格的保留管，可作雙份備份，例如 15 ml×2 管，50 ml×2 管，等。–25℃保存。

1.1.3 組織標本 ①石蠟組織：將手術切除的肝癌及癌周肝組織按病理組織切片常規固定、脫水、透明、浸蠟和包埋，一般常溫下可以保存。②新鮮組織：在完成組織學診斷后，將剩余的肝癌及癌周肝組織根據實驗用量，分成若干份，液氮或 –80℃保存。

1.2 保留管的選擇

1.2.1 塑料管 20 世紀 80年代，限于當時的條件，采用Ф 4mm 的塑料管吸取血清。具體方法是按保留血清的量截取合適長度的塑料管，置入血清，然后兩頭用酒精燈烘熱軟化、用止血鉗進行封口保存。我們曾經采用此法保留了 1 萬多份的血清樣本。實踐證明，用這種“原始”方法保存了10 多年的血清仍然有效[2]；近年來這些血清被應用于分子生物學研究，也未見血清存在質量問題[3]。在當時的條件下，這種方法不失為一種花費少、占地小、適用于基層單位保留大量標本的方法。該法的缺點是不能有序排列，尋找血樣時較麻煩，再次分裝或二次應用不方便，不能液氮或 –80℃保存（易折斷）。

1.2.2 液氮凍存管 近 20年來，我所實驗室使用液氮凍存管保留生物樣本。按照需要保留的樣本量選擇凍存管的大小，常用規格有 1.2 ml 或 1.5 ml。凍存管體積不大且能安放有序，能耐受深低溫，是理想的保留血清（漿）和白細胞的容器。在選擇商品時，我們的做法是要求廠商提供小樣，不僅外觀質量符合要求，還需經液氮或 –80℃凍存一周以上，經檢查無凍裂、無變形才確定選購。

1.3 分類編號

1.3.1 標簽制作 相對而言，采血管上的標簽信息是“暫時”的，而保存管上的標簽信息是“長期”的。早年用膠布粘貼后手寫或直接用油性記號筆標記標簽，20 世紀 90年代起逐步用激光打印機打印不干膠標簽，更有利于樣本的長期保存。在大規模的采樣工作中，因為都是直接面對被采用者，所以現場書寫標簽是常用的方法：具體做法是采用共同標識部分先行打印在采樣管上，而被采樣者的個人信息則在現場書寫，這樣做既可以節約時間又方便操作。

1.3.2 統一編號 每個隊列的每份樣品，在采集前都被確定一個唯一的編號，有隊列代號、采樣年月、個體序號等；對于隊列中同一對象多次隨訪采樣者的標號，必須有共同標識號及逐次標識號，既體現號碼的連貫性、又能方便區別不同時點樣本的特征。編號的另一個作用是借此可以連接數據庫（書面和電子）和標本庫，確保所保存的各個標本或編號具有唯一且準確的信息。

1.4 保存條件

–25℃冰箱：用于血清（漿）和尿樣標本的存放；–80℃超低溫冰柜：用于保留外周血白細胞、部分血清和手術切除標本；液氮儲存罐：主要用于保留新鮮組織標本和細胞株（系）。例如體外培養的啟東人體肝癌細胞系、癌周肝組織及甲胎蛋白（AFP）、乙型肝炎表面抗原（HBsAg）單克隆抗體細胞系等。

2 樣本的收集

2.1 “被動”收集生物標本

啟東生物標本的檢測可以追溯到 20 世紀 70年代，當時流行病學研究的重點是摸索肝癌的主要病因，因此，多學科研究主要通過分析土樣、水樣（理化指標、衛生指標及污染指標等）甚至動物標本等作地區、人群及對照的差異分析[1,4]。20 世紀 80年代，隨著對保存生物標本重要性認識的提高，以及標本保存條件的逐漸成熟，我們結合科研項目，在完成專題需要的生物標本檢測后，對檢測后剩余的標本進行收集保存。例如 20 世紀80年代末，我們開展高危險人群的肝癌篩檢項目[5-6]，在完成 HBsAg、AFP、肝功能（ALT）等常規檢測后，我們對所有 HBsAg 陽性者的血清都作了保留；對 HBsAg 陰性者，也按比例作了保留。

2.2 “主動”收集生物標本

20 世紀 80年代，隨著免疫組化研究及癌基因研究的進展，肝癌病理組織標本及生物標本收集的意義愈發顯得重要。20 世紀 90年代，因研究工作的深入和課題的需要，我們開始主動收集并保存生物學標本。例如在國際協作項目中，為研究黃曲霉毒素與肝癌的關系，評價化學預防對尿中黃曲霉毒素加合物的影響，在一定的時間段內，我們每天收集受試者的尿液，低溫保存備作后期的測試應用[7-8]。再如近年我們參加了國家重大科技專項“生物標本庫”的建立，按照設計要求，“主動”收集高發家系、雙生子家系及高危險人群及肝癌病例的生物學標本。臨床肝癌病理標本，也在不斷收集、凍存。

2.3 現有樣本數

目前我們已經建立了數個來自不同研究目的的樣本庫，包括化學預防研究、生物標志物研究、危險因子研究、雙生子遺傳資源、肝癌家系、肝癌病例對照研究、肝癌篩檢及肝癌免疫預防等標本庫，主要收集血清、血漿、尿液等生物學標本。此外，本所還保留肝癌的手術標本[石蠟塊及（或）新鮮組織]，有些還結合上述研究項目對象中出現的肝癌同時保存患者的組織學標本。現有標本庫及樣本數見表1。

表1 啟東生物標本庫

3 樣本的應用

3.1 應用于主題設計的研究

3.1.1 “即時”研究 根據設計要求確定對象、確定檢測項目，用于該專題研究。這是臨床和實驗研究最常用的方法。其特點是，在樣本數上—需要多少采多少；在樣本量上—據實驗需要量用多少采多少；在時間上—即采即用，不作保存。例如臨床常規檢驗。

3.1.2 “延時”應用 根據設計，統一采集，多適用于現場采集，然后集中到有條件的上級機構或實驗室集中檢測、統一檢測。其特點是，在檢測技術上—可能是基于工作流程、實驗試劑或質量控制的考慮；在時間上—先采后用，先臨時保存、后檢測使用；最終也不再保存樣本。例如一次性的普查采樣。

3.2 應用于項目的深入研究

3.2.1 預試研究 項目出于經費的考慮，先獲取部分樣本，然后分批檢測分析樣本；或者為實施較大的項目，先作前期的預試采樣。也可能是基于實驗技術的考慮，先試探性地檢測小樣，待條件成熟時統一檢測。因此，在樣本的處理上，實行先（前）采后用；這些樣本做完后，有時也需要繼續保存以備復檢或正式實驗時再用，也可能需要保留較長的時間。

3.2.2 擴大研究 有些實驗指標表現為“低頻率”水平，因此需要較大的樣本量。這也是基于減少抽樣誤差、提高統計學數量效率的考慮。在這種情況下，一段時間內的樣本，或者一個地區范圍內的樣本量遠遠不能滿足實驗之需，因此需要累積采樣。例如多學科的研究、多中心的研究。這些樣本，不僅有采樣對象、采樣數量的要求，而且還有統一的采樣標準、保存條件的要求。

3.3 應用于歷史比較研究

3.3.1 回顧比較 保存良好的標本，特別是同一人或者同一類的標本，不僅可為當時的研究提供檢測依據，而且還為后來的研究提供比較的基準。當這個人或這類人后來發生了某種疾病后，通過其與歷史標本指標的比較，尋找與目前疾病之間可能的聯系，從而做到“古（過）為今用”，類似于由“果”到“因”的研究[3]。例如驗證新“發現”的診斷標志物，用患者的歷史標本驗證，可以贏得隨訪確認的時間[9]。

3.3.2 前瞻比較 隊列研究是最經典的前瞻研究。它通過建立觀察者隊列，定期隨訪，采集標本并比較生物標本中所觀察指標的變化，及時發現異常，為臨床及實驗研究提供依據。前瞻研究是由“因”到“果”的研究，這個“因”可能是生物標本中的某個、某些或某類指標，通過現有標本中指標的測定，或者將現有標本保存到前瞻終止期時，與那時的標本作比較研究，從而揭示某種聯系或“因果”關系[10-11]。

3.4 應用于將來的開發研究

3.4.1 “可見”未來的研究 現有的技術、知識和證據能夠預期未來短期內建立實驗方法或發現新的標志物對現有人群的生物樣本進行檢測、分析，但目前尚不能確定具體的檢測標志物或尚不能建立確定的隨訪隊列。在此情況下，提前采集患者或受試對象的生物學標本，以備“可見”未來之用。這種設計可能適用于有較強研發實力的課題組或有長期計劃的研究機構。

3.4.2 建立生物標本庫 建立生物標本庫是一個系統工程。它是系統地有目的地收集特定人群的生物標本，以備作“將來”的研究。這個“將來”，可能沒有具體的時限，因此樣本需要長期保存。例如我們收集的雙生子遺傳資源、國家重大科技專項“樣本庫的建立”等。

4 樣本庫的維護與隨訪

4.1 現有標本的維護

4.1.1 有序 當研究工作需要獲取若干年前某一批（份）樣本時，要快速、正確地在龐大的樣本庫中找到，必須做到有序存放。我們的樣本庫做到項目分開、樣本種類分開，且按照樣本采集年份、樣本編號排序存放，方便查找、取樣。同時建立對應的樣本庫電子檔案。

4.1.2 安全 供電保障是樣本庫安全的重中之重。我們的樣本庫供電系統采用專線專用，設立報警系統，定期檢查。其次，冰柜中留有適當空間，有利于冷氣循環；適時除霜，保證冰柜保持良好的致冷效果等，都是安全冷凍的必要工作。此外，樣本庫安全還包括：有專人負責日常維護，無關人員不得擅自進入，樣本調用需獲得課題負責人同意等。

4.1.3 長期 樣本庫的建立與隨訪是一項長期的、承前啟后的工作，20 多年來，我們的樣本庫日復一日、年復一年地收集了大量的生物樣本，且今后有必要更加規范化地做好這方面的工作，因此在設計、實施過程中，要著眼于長期，除了添加設備、完善基本設施外，尤其要做好落實日常保存和維護工作。

4.2 隊列對象的隨訪

已經建立的各項目隊列既是我們開展肝癌防治研究的基本保證，也是隊列對象獲得肝病早診早治的有力保障。大多數的隊列對象能夠得到一年一次或一年兩次的免費檢查。20世紀 80年代，普查的主要方法是血清學檢測，血清學檢測異常者給予 B 超檢查；90年代以來，普遍采用血清學檢測和 B 超檢查相結合的方法進行普查[6,12]。同時對每次接受隨訪、普查的隊列對象，核對其有效證件和基本信息，記錄隊列對象的轉歸、疾病、死亡等相關信息。此外，對隊列人群給予充分的關心，建立良好的信任關系，也是提高隊列人群隨訪順從率的一個重要措施。

5 樣本庫完善的思考

5.1 基本的設施

樣本庫的基本設施包括：可控溫度的房間、冰箱（柜）、液氮罐。因地制宜、因陋就簡、逐步發展、不斷完善，是我們近 30年來樣本庫建設走過的路程。

5.2 倫理與安全

5.2.1 知情同意和簽署知情同意書 讓受試者了解項目研究的目的、益處和可能的風險，樣本的使用范圍和結果的處理等。手術標本的獲取同時需要按照醫療規范規定的方式取得患者的術前知情同意。

5.2.2 自愿原則 在說明項目研究目的后，請受試者考慮自愿參加，并允許參加者中途退出。對于老弱孕童者，則不納入“自愿”項目。

5.2.3 結果告知 對所有的患者告知基本檢測項目特別是疾病篩查體檢的結果。在啟東特定的條件下，不論何種原因收集血樣標本，我們還同時給受試者免費檢查 AFP、HBsAg、ALT 并轉告檢驗結果，對異常者給出建議性的處理意見。

5.2.4 防止交叉污染 在自然人群篩查或疾病專項篩查時，一般都包括健康人群和患病人群，為防止交叉感染或污染，嚴格實行“一人一針一管”的采血原則。

5.2.5 符合國際慣例 在國際協作中，我們既要做到符合中國人類遺傳資源管理的相關規定，同時也要符合協作國的相關規定。協作雙方要簽署合作協議，明確雙方責任與義務，以及可能的專利或版權的共享。例如在與美國科研機構的協作中，同時要注冊相應的 IRB（Institutional Review Board）及 FWA（Federalwide Assurance）的條款[13]。

5.3 穩定的隊列人群

樣本收集的目的是檢測并評價受試患者或人群。因此，首先需要選擇并確定目標人群（隊列人群），例如評價乙型肝炎表面抗原（HBsAg）與肝癌的關系，就選擇HBsAg攜帶者隊列進行長期的采樣觀察[10-11]。來自穩定的隊列人群的樣本，對于樣本結果的準確評價與推論具有重要的意義，更能反映樣本所代表人群的真實的生物標志物情況。例如根據啟東多個隊列人群（包括患者人群）采樣的研究，發現啟東人群中抗-HCV 陽性率較低，而啟東人群中 HBV 基因型以C 型為主。

5.4 受試者的順從率

隊列樣本采集中，需要對受試者進行多次隨訪采樣，因此受試者的順從率也可能對人群樣本的代表性產生影響。特別是在固定隊列人群的定期隨訪中，受試者的隨從率可以使樣本分析的效率提高、誤差減少。在現場工作中，為提高受試者的順從率，必須從一開始就做好宣傳發動工作，簽署知情同意書，說明要長期觀察、多次采樣，預先把一些可能因多種原因而不能堅持參加的對象剔除，可使隊列對象的順從率大大提高。例如我們在實施化學預防服藥的研究中，受試者被要求每天提供尿液，這種系列尿液樣本的分析，比單一尿樣的分析將更具科學性，并且能夠比較尿中生物標志物代謝的時間關系[7-8]。

5.5 統一采樣和處理

5.5.1 采血前的準備 根據樣本檢測或保留標本使用的要求，選用合適的試管、采集合適的樣本量、決定是否使用抗凝劑。

5.5.2 采血后的處理 及時分類、分裝、檢測，及時保存，采用一次性吸管吸入保存管，防止標本保存過程中的交叉污染。

5.6 標本數據庫的管理、開發與問題

標本庫的建立來源于項目、應用于項目，并且要借助基本的硬件設備進行保存、管理。啟東的生物標本庫是在完成研究項目的基礎上逐步建立、積累起來的，并且大部分的樣本來源于隊列研究。事實上，近期建立的專題標本庫也是根據主題設計而系統地收集特定對象（人群）的生物標本，因此，從標本庫管理的角度看，這也是一種隊列標本的管理。

目前我所的標本管理就是一種“隊列”標本庫的管理，從標本的存放、數據庫的管理都以隊列項目為主線，以項目課題組為管理單元。這種管理的優點是目的明確、主題清晰、樣本的時間序列容易把握、管理方便。但各隊列樣本庫分別管理的缺點是樣本存放相對分散、資源利用率相對較低，不便于樣本的集中調度和統籌、不便于隊列樣本庫之間的綜合應用。

6 展望

在啟東 30 多年的肝癌現場研究中，通過大量生物標本的分析、特別是隊列樣本的分析，已經為肝癌的流行病學研究[1,4,10-11]、病因機制研究[3,7-11]、早診早治及生物標志物的研究[3,5-6,12]以及預防研究[14]提供了寶貴的生物學基礎資料和實驗證據資料，在國內、國際的合作研究中產生了積極的影響。隨著分子生物技術的不斷進步，生物標本的應用前景將愈發廣泛，生物標本庫的作用和地位將進一步提高。我們將利用承擔國家重大科技專項“生物標本庫建立”課題的契機，完善以隊列樣本庫為基礎的生物標本庫的管理，建立編號、登記、分類、存放、管理和使用的標本建庫和調用的工作流程，使啟東的生物標本庫，在完成各承擔專項課題的前提下，成為符合生物資源利用原則的、開放性的生物標本庫平臺，為啟東乃至我國的癌癥研究、為國際協作研究積累并提供生物標本資源。

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