注射用頭孢拉宗鈉的體內外抗菌活性研究

白小剛，胡辛欣，李聰然，楊信怡，張偉新，婁人慧，游雪甫

頭孢拉宗（cefbuperazone）是由日本富山化學工業制藥株式會社于 20世紀 70年代開發，并于1985年上市的第三代頭孢類廣譜抗生素，其作用機制與其他頭孢菌素類抗生素相似，主要通過抑制細菌細胞壁的合成從而發揮殺菌作用[1-2]。頭孢拉宗在國外已有多年臨床應用經驗，其安全性和有效性已得到充分的驗證，具有穿透力強、體內分布廣的優點，在諸多部位均可達到有效治療濃度[1-2]。目前我國也已有廠家對該產品進行研發和生產[3]。因此，為評價國產頭孢拉宗的抗菌活性，本實驗以頭孢美唑、頭孢西丁、頭孢替坦、頭孢米諾、頭孢唑啉、頭孢呋辛、頭孢哌酮、頭孢吡肟為對照，對國產頭孢拉宗的體內外抗菌活性進行比較研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗藥物 注射用頭孢拉宗鈉購自桂林南藥股份有限公司；注射用頭孢美唑鈉購自日本第一三共普樂發株式會社（Daiichi Sankyo Propharma Co., Ltd.）；注射用頭孢西丁鈉購自?？谑兄扑帍S有限公司；注射用頭孢替坦二鈉購自重慶市慶余堂制藥有限公司；注射用頭孢米諾鈉購自江西東風藥業股份有限公司；注射用頭孢唑啉鈉購自華北制藥股份有限公司；頭孢呋辛購自中國藥品生物制品檢定所；注射用頭孢哌酮鈉購自麗珠集團麗珠制藥廠；注射用鹽酸頭孢吡肟購自悅康藥業集團有限公司。

1.1.2 培養基和試劑 MH 瓊脂培養基、中國藍瓊脂培養基購自中國藥品生物制品檢定所；MH 肉湯培養基、腦心浸液培養基購自美國 Difco 公司；Nitrocephin 紙片購自法國梅里埃公司；高活性干酵母購自廣州丹寶利有限公司。

1.1.3 實驗菌株 受試菌株為2008 – 2009年間自北京地區醫院收集的 20 種共 663株臨床分離致病菌（其中革蘭陽性菌 146株，革蘭陰性菌517株，產 β-內酰胺酶菌株共 535株），包括金黃色葡萄球菌 37株[產 β-內酰胺酶菌株 34株，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）16株]、表皮葡萄球菌 35株[產 β-內酰胺酶菌株 8株，耐甲氧西林表皮葡萄球菌（MRSE）17株]、化膿鏈球菌18株、肺炎鏈球菌 19株、糞腸球菌 18株（產β-內酰胺酶菌株 1株）、屎腸球菌 19株、大腸埃希菌 55株[均為產 β-內酰胺酶菌株，其中產超廣譜 β-內酰胺酶（ESBLs）菌株 26株]、肺炎克雷伯桿菌 56株（均為產 β-內酰胺酶菌株，其中產ESBLs 菌株 26株）、銅綠假單胞菌 37株（均為產 β-內酰胺酶菌株）、鮑曼不動桿菌 37株（均為產 β-內酰胺酶菌株）、奇異變形桿菌 37株（產β-內酰胺酶菌株 22株）、普通變形桿菌 37株（產β-內酰胺酶菌株 36株）、陰溝腸桿菌 37株（均為產 β-內酰胺酶菌株）、產氣腸桿菌 37株（均為產β-內酰胺酶菌株）、聚團腸桿菌 17株（產 β-內酰胺酶菌株 16株）、弗勞地枸櫞酸桿菌 37株（均為產 β-內酰胺酶菌株）、異型枸櫞酸桿菌 37株（產β-內酰胺酶菌株 36株）、雷極普魯菲登桿菌 19株（均為產 β-內酰胺酶菌株）、摩根摩根菌 37株（產β-內酰胺酶菌株 33株）和黏質沙雷菌 37株（均為產 β-內酰胺酶菌株）。質控菌株選用金黃色葡萄球菌 ATCC29213、肺炎鏈球菌 ATCC49619、糞腸球菌 ATCC29212、大腸埃希菌 ATCC25922、ATCC35218 和肺炎克雷伯桿菌 ATCC700603、銅綠假單胞菌 ATCC27853，所有質控菌株均購自美國模式培養物集存庫（ATCC），且最低抑菌濃度（MIC）均在美國臨床實驗室標準化協會（CLSI）規定范圍內。細菌 β-內酰胺酶鑒定采用Nitrocephin 紙片法，并按照 CLSI[4]規定方法鑒定細菌 ESBLs。

1.1.4 實驗動物 外觀健康 ICR 小鼠 720 只，雌雄各半，4～5 周齡，體重 18～22 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK（京）2007-0001。實驗前 1 天預養以適應環境。

1.2 方法

1.2.1 MIC 測定 參照 CLSI[5]標準方法，采用平皿二倍稀釋法和 Denley 多點接種器進行藥敏實驗。藥物用 MH 肉湯培養基進行二倍稀釋，使其終濃度依次為0.03～128 μg/ml，將適量各梯度濃度藥物分別加入平皿中，與 MH 瓊脂培養基混勻。以多點接種器接種實驗菌（接種量為1×104cfu/點），接種后置 35℃恒溫培養 18 h 觀察結果，無菌生長的平皿中所含藥物的最小濃度即為MIC。

1.2.2 最低殺菌濃度（MBC）測定 選取金黃色葡萄球菌 12株、大腸埃希菌 13株、肺炎克雷伯桿菌 12株為實驗菌，采用試管二倍稀釋法確定各實驗菌的 MIC（接種量為5×105cfu/ml）后，依次吸取未見細菌生長各管的培養液各 0.1 ml，轉移到不含抗生素的瓊脂平皿中，置 35℃恒溫培養18 h 觀察結果，菌落數小于 50 個（至少 99.9%接種菌被殺死）的平皿中所含最低藥物濃度即為MBC。

1.2.3 殺菌曲線（KCs）測定 以金黃色葡萄球菌ATCC29213、大腸埃希菌 ATCC25922 為實驗菌，過夜培養后分別接種于 MH 瓊脂培養基中（接種量為1×105cfu/ml），35℃培養 30min 后加入頭孢拉宗鈉注射液，調整藥物的終濃度分別為8 MIC、4 MIC、2 MIC、1 MIC、0.5 MIC、0（空白對照組），置 35℃繼續培養，并分別在培養 2、4、6、8、12、24 h 時取樣，于營養瓊脂平板上計活菌落數，繪制時間-菌落數對數曲線即 KCs。

1.2.4 誘導耐藥實驗 以金黃色葡萄球菌ATCC29213、金黃色葡萄球菌 15、大腸埃希菌ATCC25922、大腸埃希菌 1515、肺炎克雷伯桿菌ATCC700603、肺炎克雷伯桿菌 7 為實驗菌，選取頭孢美唑、頭孢西丁、頭孢替坦和頭孢米諾作為對照藥物。以各抗生素對受試菌株的 1/4 MIC 每天轉種，誘導 20 d，并于誘導第4、8、12、16、20 天時，采用金黃色葡萄球菌 MH 肉湯微稀釋法測定抗生素對各菌株的 MIC，觀察藥物對受試菌的誘導耐藥情況。

1.2.5 體內抗菌活性測定 將 720 只 ICR 小鼠進行隨機分組，每組 10 只。以大腸埃希菌ATCC25922、大腸埃希菌 1515、肺炎克雷伯桿菌9613、肺炎克雷伯桿菌 7、金黃色葡萄球菌 15 為感染菌，選取頭孢美唑、頭孢唑啉作為對照藥物。用 5%高活性干酵母稀釋受試菌株，于小鼠腹腔注入 100%最小致死量（MLD）的菌液 0.5 ml，實驗組小鼠感染后 15min 和 6 h 分別皮下給藥2 次，空白對照組小鼠感染后不給藥，觀察 7 d 內小鼠的生存數量，并利用 Bliss 法[6]計算半數有效劑量（ED50）及其 95%可信區間，進行統計學處理。

給藥方案：①大腸埃希菌 ATCC25922 感染量為1.3×106cfu/鼠，藥物劑量分別為：頭孢拉宗1.5、2、3、4.2、6 mg/kg，頭孢美唑 25、35、50、70、100 mg/kg，頭孢唑啉 3.5、5、7、10、14 mg/kg；②大腸埃希菌 1515 感染量為3.6×106cfu/鼠，藥物劑量分別為：頭孢拉宗 0.06、0.09、0.13、0.18、0.25 mg/kg，頭孢美唑 2.5、3.5、5、7、10 mg/kg，頭孢唑啉 2.5、3.5、5、7、10 mg/kg；③肺炎克雷伯桿菌 9613 感染量為7×106cfu/鼠，藥物劑量分別為：頭孢拉宗 0.18、0.25、0.35、0.5、0.7 mg/kg，頭孢美唑 5、7、10、14、20 mg/kg，頭孢唑啉 5、7、10、14、20 mg/kg；④肺炎克雷伯桿菌 7 感染量為7×105cfu/鼠，藥物劑量分別為：頭孢拉宗50、70、100、140、200 mg/kg，頭孢美唑 1000 mg/kg，頭孢唑啉 1000 mg/kg；⑤金黃色葡萄球菌 15 感染量為2.6×105cfu/鼠，藥物劑量分別為：頭孢拉宗50、70、100、140、200 mg/kg，頭孢美唑 25、35、50、70、100 mg/kg，頭孢唑啉 3.5、5、7、10、14 mg/kg。所有藥物配制時均按實際活性藥物計算濃度。

1.3 統計學處理

應用 SPSS 13.0 統計學軟件進行數據處理，組間檢測結果的比較采用 LSD 法，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 臨床分離菌的 MIC 分布

體外 MIC 測定結果表明，注射用頭孢拉宗鈉具有廣譜抗菌活性，對 663株臨床分離菌均有不同程度的抗菌作用，其中對 146株革蘭陽性菌的抗菌活性較弱，對 517株革蘭陰性菌普遍具有較強的抗菌作用（表1）。

表1 頭孢拉宗對 663株臨床分離菌的體外抗菌活性（MIC，μg/ml）Table 1 The antibacterial activity of cefbuperazone against 663 clinical isolated bacteria in vitro (MIC, μg/ml)

頭孢拉宗對革蘭陽性菌，包括耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）、耐甲氧西林表皮葡萄球菌（MRSE）的抗菌活性較弱，MIC50值在 16 μg/ml以上，抗菌活性與頭孢米諾、頭孢替坦相近。對糞腸球菌和屎腸球菌的抗菌活性弱，MIC50值均大于128 μg/ml，抗菌活性與其他同類受試藥物相近。

頭孢拉宗對多種革蘭陰性菌均具有較高的抗菌活性。其中對大腸埃希菌、肺炎克雷伯桿菌及其產 ESBLs 菌株的抗菌活性較強，MIC90值均為8 μg/ml，抗菌活性與頭孢替坦和頭孢米諾相近，較頭孢吡肟和頭孢西丁強 2～8 倍，明顯優于頭孢呋辛、頭孢唑啉和頭孢哌酮。對腸桿菌的抗菌活性較強，MIC50值在 0.125～8 μg/ml 范圍內，MIC90值在 8 μg/ml以上，抗菌活性較頭孢替坦、頭孢呋辛和頭孢哌酮強 2～32 倍，明顯優于頭孢美唑、頭孢西丁、頭孢米諾和頭孢唑啉，弱于頭孢吡肟；但對雷極普魯菲登桿菌的抗菌活性較弱，MIC50、MIC90值均為64 μg/ml，抗菌活性略優于頭孢西丁、頭孢哌酮、頭孢唑啉和頭孢呋辛，弱于頭孢米諾、頭孢吡肟、頭孢替坦和頭孢美唑 4～32 倍。

頭孢拉宗對銅綠假單胞菌和鮑曼不動桿菌等非發酵桿菌抗菌活性較弱，MIC50、MIC90值均大于 128 μg/ml，與多數其他同類受試藥物相近，其中對銅綠假單胞菌的抗菌活性弱于頭孢哌酮和頭孢吡肟，對鮑曼不動桿菌的抗菌活性稍弱于頭孢米諾和頭孢吡肟。

2.2 最低殺菌濃度（MBC）

注射用頭孢拉宗鈉對 12株金黃色葡萄球菌的 MBC50/MIC50、MBC90/MIC90比值均為2，對13株大腸埃希菌和 12株肺炎克雷伯桿菌的MBC50/MIC50、MBC90/MIC90比值均為1（表2）。

2.3 殺菌曲線（KCs）

頭孢拉宗鈉注射液對大腸埃希菌 ATCC25922、金黃色葡萄球菌 ATCC29213 的殺菌曲線測定結果見圖1、圖2。

表2 頭孢拉宗對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌和肺炎克雷伯桿菌的 MBC/MIC 比較Table 2 MBC/MIC of cefbuperazone against E.coli, K.pneumoniae and S.aureus

圖1 頭孢拉宗對大腸埃希菌 ATCC25922 的殺菌活性Figure 1 The antibacterial activities of cefbuperazone against E.col ATCC25922

圖2 頭孢拉宗對金黃色葡萄球菌 ATCC29213 的殺菌活性Figure 2 The antibacterial activities of cefbuperazone against S.aureus ATCC29213

2.4 誘導耐藥實驗

誘導耐藥實驗結果表明，分別以 1/4 MIC 劑量誘導 20 d 后，頭孢拉宗及其對照藥對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌和肺炎克雷伯桿菌的抗菌活性無明顯改變（表3）。

2.5 體內抗菌活性

頭孢拉宗及其對照藥皮下給藥對感染小鼠的體內療效結果顯示，頭孢拉宗對金黃色葡萄球菌15 感染小鼠的體內療效與頭孢美唑相近（P＞0.05），但弱于頭孢唑啉（P＜0.01）；頭孢拉宗對大腸埃希菌 ATCC25922、大腸埃希菌 1515、肺炎克雷伯桿菌 9613、肺炎克雷伯桿菌 7 感染小鼠的體內療效明顯優于頭孢美唑和頭孢唑啉（均P＜0.01，表4）。

3 討論

頭孢拉宗，又名頭孢拉宗鈉、頭孢布宗鈉、乙氧哌甲氧頭孢菌素鈉等，其化學名稱為(6R, 7S)-7-[(2R, 3S)-2-(4-乙基 2, 3-二氧代-1-哌嗪甲酰氨基)-3-羥基丁酰氨基]-7-甲氧基-3-{[(1-甲基-1H-四唑-5-基)硫]甲基}-8-氧代-5-硫雜-1-氮雜雙環[4.2.0]辛-2-烯-2-羧酸，屬第三代頭孢類抗生素，具有廣譜的抗菌活性，對革蘭陽性、革蘭陰性細菌和厭氧菌均有作用，其中對厭氧菌作用優于一般第三代頭孢菌素類抗生素。此外，7 位甲氧基的引入使得頭孢拉宗對 β-內酰胺酶的穩定性增加，且優于多數同類品種[1-2]，而本研究結果也證實，頭孢拉宗對產 β-內酰胺酶菌株具有較強的抗菌作用。

本研究表明，頭孢拉宗對革蘭陰性菌特別是大腸埃希菌和肺炎克雷伯桿菌具有較強的抗菌作用，對革蘭陽性菌的抗菌作用較弱。除銅綠假單胞菌、雷極普魯菲登桿菌和鮑曼不動桿菌外，頭孢拉宗對大腸埃希菌（包括產 ESBLs 大腸埃希菌）、肺炎克雷伯桿菌（包括產 ESBLs 肺炎克雷伯桿菌）、奇異變形桿菌、普通變形桿菌、產氣腸桿菌、陰溝腸桿菌、聚團腸桿菌、弗勞地枸櫞酸桿菌、異型枸櫞酸

桿菌、摩根摩根菌和黏質沙雷菌均具有較強的抗菌活性，其對革蘭陰性菌的體外抗菌活性大多優于頭孢西丁、頭孢美唑、頭孢唑啉、頭孢哌酮、頭孢替坦和頭孢呋辛，但稍弱于頭孢吡肟；對革蘭陽性菌的體外抗菌活性與頭孢替坦和頭孢米諾相近。MBC和 KCs 測定結果表明，頭孢拉宗對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、肺炎克雷伯桿菌均呈現殺菌作用，且以 1/4 MIC 劑量誘導 20 d 對其抗金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌和肺炎克雷伯桿菌的活性無明顯影響。頭孢拉宗皮下給藥對大腸埃希菌、肺炎克雷伯桿菌、金黃色葡萄球菌腹腔感染小鼠具有較好的體內抗菌活性，對大腸埃希菌 ATCC25922、大腸埃希菌 1515、肺炎克雷伯桿菌 7、肺炎克雷伯桿菌 9613 感染小鼠的體內療效明顯優于頭孢美唑和頭孢唑啉，對金黃色葡萄球菌 15 感染小鼠的體內療效與頭孢美唑相近，弱于頭孢唑啉。

表3 頭孢拉宗及其對照藥的體外誘導耐藥實驗結果（MIC，μg/ml）Table 3 In vitro induction of resistance to cefbuperazone and control drugs (MIC, μg/ml)

表4 頭孢拉宗及其對照藥皮下給藥對感染小鼠的體內療效比較Table 4 Effects on systemically infected mice of cefbuperazone and control drugs given by subcutaneous

綜上，本研究對照多種其他同類藥物，研究證實了國產頭孢拉宗具有較強的體內外抗菌活性，為該藥物的開發和應用提供了依據。

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