LINE-1 ORF-1p過表達對肝癌細胞株SMMC7721增殖和錨定非依賴性生長的影響*

高旭東 陸蔭英 馮帆 王春平 王 常秀娟 楊永平

研究證實反轉座子LINE-1，又稱長散布核元件（Long Interspersed Nucleotide acids Element-1，L1），與腫瘤的發生密切相關。在正常成體組織和細胞中L1均處于沉默狀態，其主要相關機制是啟動子區的甲基化修飾和RNAi，但在生殖細胞、胚胎細胞發育早期及腫瘤細胞中，L1啟動子發生去甲基化[1～3]，進而被廣泛激活，引發反轉座的發生，并調控相關宿主基因表達，從而影響細胞增殖、分化、凋亡等生物學行為。此外，L1的表達與反轉座還能夠對基因組產生相當的破壞，如誘發突變和基因組的不穩定性[3～5]，在大多數惡性腫瘤細胞中呈明顯高表達[6]，與腫瘤細胞的生物學特性密切相關[7]。人的L1基因長約6 kb，分別編碼開放讀碼框 -1p（open reading frame-1p，ORF-1p）和ORF-2p兩個蛋白。ORF-2p自身具有核酸內切酶活性，能切割靶基因位點并以靶基因DNA為引物，以自身RNA為模板在其自身反轉錄酶活性作用下完成反轉座過程[7]；而ORF-1p則與RNA以及單鏈DNA有高親和力，是ORF-2p調節反轉座必要的伴侶，被認為與腫瘤細胞中L1的高表達及促進腫瘤細胞的增殖密切相關[8]。

本研究利用帶Flag標簽的L1 ORF1p表達載體，研究在肝癌細胞SMMC7721中表達的ORF-1p對腫瘤細胞生物學特性及肝癌相關調控蛋白報告基因表達的影響，結果發現L1 ORF1p能夠單獨發揮作用，參與調節腫瘤細胞的增殖，為闡明各種腫瘤的發生機制開辟了一個新的思路。

材料與方法

一、細胞與試劑 肝癌細胞SMMC7721、大腸桿菌 DH5α、pCDNA3.0-Flag-ORF1、pCDNA3.0-Flag、p15-luc、p21-luc和p53-luc報告基因等由軍事醫學科學院八所七室保存并提供。質粒提取試劑盒和MTT為Ameresco公司產品。其他包括DMEM（Gibco公司）、胰酶（Ameresco）、特級胎牛血清（Gibco公司）、細胞轉染試劑（LipofectAMINE 2000 Invitrogen公司）、抗L1-ORF1p單克隆抗體（本室自制）、兔抗GADPH 多克隆抗體（Sigma公司）和辣根過氧化物酶偶聯的羊抗兔IgG（Santa Cruz公司）等。

二、細胞轉染 復蘇SMMC7721細胞，接種到6cm平皿中，使用含10%小牛血清的DMEM培養基，在37℃，5%CO2常規條件下培養。當細胞密度達到80%時，使用Lipofectamine 2000按照說明書所述方法轉染pCDNA3.0-Flag-ORF1表達載體和相應空載體，轉染48h后收集細胞。

三、Western blotting檢測細胞L1 ORF1p的表達 收集細胞，加入50μL SDS-裂解緩沖液，煮沸10 min變性，將上述變性的細胞總蛋白離心后取上清進行12.5%SDS-PAGE電泳。電泳結束后，將蛋白轉移至硝酸纖維素膜上，用5%脫脂奶粉（用1×TBST配制）于室溫下進行封閉1h，然后加入兔抗ORF-1p單克隆抗體（1:500），室溫輕搖1h，用TBST洗膜3次，然后加入辣根過氧化物酶偶聯的羊抗兔IgG（1:5000），于室溫下孵育1h后，用TBST洗膜3次，最后加入化學發光底物1ml，室溫下作用5min，將膜放到曝光盒內，在暗室中取出感光膠片加蓋在膜上，壓蓋曝光10s后沖洗膠片。另檢測內參蛋白GADPH表達，方法同前，其中的一抗為兔抗GADPH多克隆抗體。

四、細胞增殖檢測 取SMMC7721細胞鋪于96孔培養板中，分別轉染Flag-ORF1表達載體和相應空載體，采用MTT法對活細胞計數，以平均值繪制生長曲線。

五、腫瘤細胞軟瓊脂成集落實驗 取SMMC7721細胞，分別轉染表達載體和相應空載體。預先配置1.2%和0.7%的瓊脂溶液，滅菌。預先用1.2%瓊脂鋪平皿，待其凝固，備用。培養轉染的SMMC7721細胞，24h后用配置20%血清的兩倍DMEM重懸細胞，取細胞（1×104個）懸液，與0.7%瓊脂溶液等體積混合，加于上層。培養17～20日，觀察、計數。

六、Luciferase報告基因轉錄活性測定 利用熒光素酶和β-半乳糖苷酶活性測定方法檢測p21、p15和p53報告基因轉錄活性。取SMMC7721細胞，分別轉染表達載體和相應空載體，同時轉染各種報告基因以及表達β-半乳糖苷酶質粒，轉染24h后，收集并震蕩裂解細胞，離心收集上清，分別測熒光素酶活性及β-半乳糖苷酶活性，間接評價各種報告基因的轉錄活性。

七、統計學處理 采用SPSS13.0統計分析軟件，數據以±s表示，組間差異采用t檢驗，P＜0.05被認為有統計學意義。

結果

一、L1 Flag-ORF-1p能夠在SMMC7721細胞中表達 肝癌細胞SMMC7721轉染Flag-L1ORF1后，應用Western blot法檢測各組細胞ORF-1p的表達水平。結果發現，Flag-L1ORF1轉染細胞ORF-1p的表達明顯高于對照組（P＜0.05，圖 1）。

二、ORF-1p能夠促進肝癌SMMC7721細胞的生長 在實驗組細胞表達ORF1p后，細胞增殖能力明顯強于對照組（P＜0.05，圖 2），說明 ORF1p 能促進腫瘤細胞的生長。

三、ORF-1p能夠促進SMMC7721細胞的錨定非依賴性生長（anchorage-independent growth） 錨定不依賴性生長是腫瘤細胞的特性之一，也是其發生轉移的前提。將SMMC7721細胞轉染Flag-L1ORF1表達載體和相應空載體，24h后進行軟瓊脂成集落實驗，檢測細胞的集落大小和數量，能反應SMMC7721細胞錨定非依賴性生長能力的改變。結果顯示：ORF-1p能夠顯著增大SMMC7721細胞集落的數量和面積（P＜0.05，圖 3）。

四、L1 ORF-1p能夠影響細胞增殖相關基因的表達 我們選擇與肝癌細胞生長密切相關的p21、p15和p53基因，對其轉錄活性進行檢測，以對應孔熒光素酶活性與β-半乳糖苷酶活性比值作為其轉錄活性的相對水平。其中，β-半乳糖苷酶起著校正細胞轉染效率的作用。實驗結果表明，細胞過表達ORF1p后，p53、p15和p21等報告基因的轉錄活性均有不同程度的降低（P＜0.05，圖 4），可能系 ORF1-1p 抑制了它們的表達。

討論

隨著功能基因組研究的深入，過去曾被稱作“垃圾DNA”的反轉座子L1由于與腫瘤形成、進展密切相關而逐漸受到關注。在其編碼的兩個蛋白ORF-1p和ORF-2p中，ORF2p已被證實與L1反轉座過程密切相關，而ORF-1p大小僅40kDa，表達量遠遠高于ORF2p，與其它任何蛋白缺乏序列相似性，其功能尚不十分清楚。

為研究ORF-1p在腫瘤細胞中的具體作用，我們曾利用RNAi干擾技術降低肺癌細胞A549 ORF1p的表達，發現A549細胞生長減慢，成瘤能力明顯減弱[9]。由此我們推測，L1 ORF-1p具有促進腫瘤細胞增殖和侵襲的能力。為明確L1 ORF-1p是否與肝細胞癌的發生、發展相關，在本研究中，我們設計構建了L1 ORF-1p相關表達載體并進行了相關研究。我們將構建好的pCDNA3.0-Flag-ORF1真核表達載體在肝癌細胞系SMMC7721中表達，經檢測表明，在實驗組ORF1p的表達明顯高于對照組，證實L1 Flag-ORF-1p能夠在SMMC7721細胞中表達。進一步檢測顯示在SMMC7721細胞，過表達ORF-1p能使細胞的增殖能力明顯增強；同時軟瓊脂錨定的克隆形成試驗顯示，實驗組細胞的集落形成能力明顯增加，表現為集落形成數目增加，集落體積增大。由上述實驗可以看出，ORF-1p能促進細胞增殖和錨定生長。

野生型p53（wtp53）蛋白能夠調節p21和p15等多個基因的表達，從而控制細胞增殖、抑制細胞轉化，阻止癌變過程。在細胞受損后p53通過停止細胞分裂或者觸發分子信號級聯反應造成細胞凋亡來保護機體。p21屬于CKIs中的Cip/Kip家族成員，能與CDK結合而抑制CDK的活性[10]。有報道p21可以抑制SMMC-7721細胞的細胞周期進程，對抗凋亡的發生，并參與肝癌的侵襲轉移過程。p15是CDK4的負調控因子，能特異性地抑制細胞周期依賴激酶CDK4/CDK6活性，抑制Rb蛋白磷酸化，從而抑制細胞的增殖，同時P15也是TGF-β介導的誘導分化和生長抑制的效應因子，p15基因失活可導致細胞逃避TGF-β介導的生長抑制作用[11]。因此，p53、p15和p21基因的表達與肝癌細胞的增殖和侵襲密切相關，上述癌基因的表達失活將使細胞失去正常的生長調控，促進腫瘤形成和進展。因此，我們利用Luciferase報告基因活性測定法進一步檢測在L1 ORF-1p過表達的SMMC-7721細胞中p53、p15和p21報告基因的轉錄活性，結果顯示L1 ORF-1p的表達能夠明顯降低p53、p15和p21報告基因的轉錄活性，從而抑制相關蛋白質產物的表達，影響下游調控作用的發揮。由此我們推測：ORF-1p有可能在細胞中通過影響p21、p53和p15等的表達，促進細胞增殖和腫瘤侵襲。

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