糖尿病神經病理性痛大鼠脊髓背角凋亡細胞與凋亡蛋白酶caspase-3的表達變化

吳川 王秀麗 王倩 劉彥濤 董蕊 劉朋

糖尿病神經病理性痛(diabetic neuropathic pain，DNP)發病機制尚不完全清楚，可能與高血糖引起的神經營養與代謝障礙有關［1］，而細胞凋亡參與了糖尿病神經痛的發生發展［2］，但DNP大鼠脊髓背角神經元凋亡機制目前仍不十分清楚。本試驗利用DNP大鼠模型，對脊髓背角的凋亡細胞及與之相聯系的凋亡蛋白酶caspase-3進行了觀察，以探討在DNP的發展過程中，脊髓背角凋亡細胞及凋亡蛋白caspase-3的變化。

1 材料與方法

1.1 動物選擇及分組 清潔級雄性SD大鼠60只，由河北醫科大學動物試驗中心提供，4周齡，體重150～170 g，室溫20～25℃，晝夜交替，自由進食水，適應環境5 d進行試驗。隨機分為正常對照組(C組)和DNP組(D組)，每組30只。

1.2 DNP模型的制備 參考文獻［3］介紹的方法，禁食12 h后腹腔注射鏈脲霉素(STZ，批號:S0130，Sigma公司，美國)50 mg/kg，C組給予等容量0.9%氯化鈉溶液。分別給予注射STZ 或0.9%氯化鈉溶液后1、2、3 周采集尾靜脈血樣0.5 ml，采用酶學方法測定空腹血糖濃度，ACCU-CHEK血糖分析儀由德國Roche公司提供，D組空腹血糖濃度＞16.7 mol/L為糖尿病模型制備成功，否則剔除，予以補充。采集血樣后待大鼠安靜后用Von Frey針測定機械縮足閾值;當縮足閾值低于4 g時為糖尿病神經痛模型成立;在腹腔注射后3、5、7周取L1～5節段脊髓組織，采用TUNNEL法和免疫組織化學法染色分別測定凋亡細胞與凋亡蛋白酶Caspase-3的表達。

1.2.1 機械縮足閾值的測定:參照文獻［3］介紹的方法，采用“up-and-down”方式，將大鼠置于金屬網上，蓋以透明的有機玻璃罩。使大鼠適應環境15 min，用一系列標準化的Von Frey針(Stoelting Wood公司，美國)垂直刺激大鼠后足底，使其彎曲成S形，持續8 s，在刺激時間內或在移開Von Frey絲時發生縮足反應，記為陽性反應，直至出現第1次陽性陰性(或陰性陽性)反應的騎跨，連續測4次。采用Dixon［4］介紹的方法計算50%縮足反應閾值。

1.2.2 取材:分別于注射前、注射后3、5、7周每組各取10只大鼠，腹腔注射1%戊巴比妥鈉40 mg/kg麻醉下，迅速開胸，經左心室至升主動脈插管，先以100 ml 0.9%氯化鈉溶液洗去血液，隨后用含4%多聚甲醛的磷酸緩沖液(0.1 mol/L，pH值7.4)灌注1 h，取L1～5節段脊髓組織。常規固定、脫水、石蠟包埋，切片(片厚5 μm)。分別行原位末端標記法(TUNEL)和caspase-3免疫組化染色。

1.2.3 TUNEL法染色:TUNEL法檢測步驟按試劑盒(購自德國Roche公司)說明書進行。過氧化物酶二氨基聯苯胺(DAB)顯色，陽性細胞為細胞核中有棕黃色顆粒。陰性對照:未端脫氧核苷酸轉移酶(TDT酶)用含有核苷酸混合液的反應液替代，其余步驟均相同。Olympus光學顯微鏡×400倍下觀察并計數大鼠脊髓背角TUNEL標記的陽性細胞數。根據細胞的形態、大小、分布區域等，確認脊髓背角TUNEL標記的陽性細胞數。

1.2.4 caspase-3免疫組織化學法染色:采用免疫組織化學染色法進行抗caspase-3染色，操作步驟按試劑說明書進行。兔抗大鼠caspase-3多克隆抗體(美國Santa Cruz公司，1∶200)，生物素標記的羊抗兔IgG(1∶200)和辣根過氧化物酶標記的鏈酶卵白素(1∶100)均購自美國 Zymed公司。陰性對照用0.01 mol/L PBS代替caspase-3抗血清，其余步驟均相同。在Olympus光學顯微鏡×400倍下觀察并計數整個脊髓背角內caspase-3免疫反應陽性細胞數。采用Motic Digital Image病理圖像采集軟件(Olympus公司，日本)與 Quantity One軟件(Bid-Rad公司，美國)進行分析，每個標本取4張切片，每張切片在脊髓背角選取大致相同部位的視野，光鏡(200倍)計數陽性細胞數，取4張切片的平均值反映TUNEL染色和caspase-3陽性細胞的表達水平。

1.3 統計學分析應用SPSS 13.0統計軟件，計量資料以表示，組間比較采用成組設計t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 2組空腹血糖和機械縮足閾值比較 給予STZ后不同時點機械縮足閾值＜4 g;與C組比較，D組空腹血糖升高，機械縮足閾值降低 (P＜0.05)。見表1。

2.2 2組脊髓脊角凋亡細胞及Caspace-3表達比較 注射3周后與C組比較，D組各時點凋亡細胞及caspase-3表達均顯著增加(P＜0.05)，D組各時間點之間比較差異有統計學意義(P＜0.05)。見表2。

表1 2組大鼠給予STZ后不同時點空腹血糖及機械縮足閾值的比較n=10，

表1 2組大鼠給予STZ后不同時點空腹血糖及機械縮足閾值的比較n=10，

注:與C組比較，*P＜0.05

組別 血糖(mmol/L)機械縮足閾值(g)3周 5周 7周3周 5周 7周.2±2.8 D 組 24.4±3.6* 27.3±3.1* 26.7±3.4* 2.9±0.4* 3.1±0.4* 3.2±0.5 C 組 5.4±0.6 5.0±0.8 4.9±0.8 12.9±2.1 13.8±2.8 11*

表2 2組大鼠給予STZ后不同時點脊髓背角凋亡細胞及Caspase-3表達的比較n=5，

表2 2組大鼠給予STZ后不同時點脊髓背角凋亡細胞及Caspase-3表達的比較n=5，

注:與 C 組比較，*P＜0.05;與3周比較，#P＜0.05;與5周比較，△P＜0.05

方法C組D 組3周 5周 7周3周 5周 7周TUNEL法 77±11 81±11 80±14 138±15* 217±14*# 322±13＊△Caspase-3染色 99±20 95±21 99±20 168±16* 230±20*# 336±20＊△

2.3 染色觀察 于脊髓背角可以觀察到TUNEL染色陽性的細胞核，呈棕黃色或黃色，對照組偶可見TUNEL陽性細胞的表達。表達caspase-3陽性的細胞呈棕黃色，免疫陽性反應物多定位于神經元胞漿與突起的根部，胞核有時也有表達，在對照組可見少量表達。見圖1、2。

3 討論

糖尿病神經病變是糖尿病最常見的并發癥之一，其發病機制復雜，與代謝、血管病變等因素有關［5］，糖尿病所致高血糖、脂質代謝紊亂、神經內膜缺血可導致機體過度氧化應激。而氧化應激是糖尿病周圍神經病變的基礎［6］。高血糖可引起內皮細胞中核轉錄因子(NF-κB)的激活，導致活性氧(reactive oxygenspecies，ROS)生成增多，從而誘導神經元發生退行形變［7］，導致神經元的凋亡壞死、結構與功能發生改變。而隨著糖尿病周圍神經病變病程的進展，脊髓背角神經細胞凋亡變化的規律，未見明確報道。我們通過腹腔注射STZ，并于注射后1周開始抽取大鼠尾靜脈血檢測血糖，確保制造成功的糖尿病大鼠模型，應用up-and-down法確保DNP大鼠造模成功。通過對糖尿病周圍神經病變進程不同時點大鼠模型脊髓背角凋亡細胞及與之相關聯的凋亡蛋白caspase-3進行研究，以探討隨著糖尿病周圍神經病變的進展，脊髓背角神經元凋亡細胞與凋亡蛋白caspase-3的表達變化。

圖1 2組大鼠脊髓背角凋亡細胞(TUNNEL×400)

圖2 2組大鼠脊髓背角凋亡蛋白Caspase-3(免疫組化×400)

研究認為:神經元暴露在高糖狀態下2 h即可產生明顯的氧化應激反應，并啟動細胞的程序化死亡即細胞凋亡［8］。在糖尿病的動物中，過氧化應激對神經膠質細胞的損傷造成DPN中的脫髓鞘病變，導致神經傳導速度減慢及痛覺的出現。氧化應激反應還可通過細胞內的各種調節通路激活細胞信號轉導分子，如NF-κB、MAPKs等，最終改變細胞內的基因表達、蛋白功能，使內皮細胞和神經元功能失調、細胞凋亡［9，10］。另外，高血糖本身還可通過產生advanced glycation end products(AGE)而破壞血管內皮功能，AGE與其受體結合，激活NF-κB，引起血管炎癥，形成糖尿病神經血管病變，最終導致血管神經細胞生成減少，凋亡增加［11］，這是目前認為引起DNP的病理學基礎。

神經元氧化應激發生后，神經元異常放電頻率增加，表現為神經元興奮性增高［12，13］，在這一系列的反應中，ATP信號的級聯反應、膠質細胞的活化、電壓門控的離子通道(K+、Ca2+)、PKC/PLC活性均發揮重要作用，同時也與P38和JNK信號通路的活化狀態密切相關［6］。而糖尿病的糖代謝異常，直接影響了細胞外的三磷酸腺苷(extracellular adenosine triphosphate，excATP)的生理作用，使excATP生成發生變化［14］。excATP是各種病理生理條件下釋放到細胞外并進入細胞間質的ATP，它并不能直接向細胞提供能量，但可以在細胞間充當信使，傳遞神經遞質和炎性介質，是神經病理性疼痛進程中一種重要的膠質細胞活化始動因子。研究證實:在高血糖狀態下，細胞內第二信使二酰甘油合成增加，并與PKC亞型調節區結合，從而激活PKC，PKC通路的激活導致下游基因表達變化，如激活促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)，使轉錄因子氧化磷酸化，改變基因表達，進而提高細胞內氧化應激水平［15，16］。在上述一系列變化中，Ca2+的參與必不可少［16］，該通路也是目前治療DNP的一個新靶點。

Caspases即半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶，Caspases的超表達和激活可導致細胞凋亡的發生，因此Caspases又被稱為死亡蛋白酶，其中Caspases-3是介導細胞凋亡的核心蛋白［17］。本實驗發現:注射STZ 3周后，脊髓背角凋亡細胞及其與之相聯系的Caspases-3蛋白表達均明顯增強，表明糖尿病大鼠氧化應激反應啟動 MAPK通路和Caspase通路，Caspase可激活MAPKs通路中的上游蛋白激酶，誘導JNK和(或)p38磷酸化，表達P53和fas配體，及核轉錄因子(NF-κB)，從而誘導細胞凋亡。

本實驗證實了隨著糖尿病周圍神經病變的發展，脊髓背角神經元的凋亡表達呈遞增趨勢。明確了糖尿病周圍神經病變與脊髓背角神經元凋亡的關系，將為理解及治療糖尿病周圍神經病變提供新的思路與方法。

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