宣導瀉肺飲對大鼠心肌細胞L型Ca2+通道電流影響及機制研究*

朱 浩 范曉波 賀 勁 廖艷林 楊祥坤湖北省武漢市中醫院（湖北武漢430014）

心律失常是心血管病常見的致死因素，目前缺乏十分有效的減少心律失常發生的藥物。本研究采用全細胞膜片鉗記錄技術來觀察宣導瀉肺飲含藥血清對大鼠心室肌細胞L-型Ca2+通道的影響，以探討宣導瀉肺飲含藥血清藥理作用相關機制。

1 材料與方法

1.1 材料 成年SD大鼠 30只，清潔級，體質量200～250g，由華中科技大學同濟醫學院實驗動物中心提供。宣導瀉肺飲濃縮液由武漢中醫院制劑室提供；小牛血清蛋白（BSA）、膠原酶Ⅱ型、牛磺酸和氯化銫（CsCl）購自美國Sigma公司；天門冬氨酸合L-谷氨酸由中國科學院上海生物化學研所提供；其他試劑均為國產分析純或化學純試劑。

1.2 宣導瀉肺飲含藥血清的制備 SD大鼠隨機分為空白血清組和宣導瀉肺飲含藥血清組，各15只。含藥血清組按0.55g/kg加蒸餾水3mL，配制成宣導瀉肺飲流浸膏藥液灌服，每日1次，連續8d。空白血清組給等體積生理鹽水灌胃，方法同含藥血清組。在末次灌胃2h后固定大鼠，眼眶采血。室溫下靜置30min后取上清液，2500r/min離心25min，分離血清，置于56℃水浴30min滅活，過0.22μm孔濾膜濾過除菌，分裝，-20℃條件下保存備用。

1.3 心肌單細胞的分離 大鼠經苯巴比妥鈉麻醉后迅速取出心臟，立即置冰冷飽和氧的無鈣臺氏液中進行修剪，然后經主動脈將心臟懸掛于Langedorff灌流器上，以正常臺氏液約8mL連續灌流5min，然后用無鈣臺氏液灌流約10min至心臟停搏，換膠原酶液灌流分離心臟單細胞，待心臟變軟和膨松變大，心肌呈粉紅色半透明時，可以開始取心臟組織。然后用KB液沖洗殘酶約3～5min，最后將心臟從Langendorff裝置上取下，剪下心室置于37℃冰箱KB液中剪碎，將取下的心室肌組織放于裝有KB液的試管中，在溫育下用粗頭吸管輕輕吹打3～5min，使之分散成單個細胞，經過150～200μm的微孔尼龍膜濾過后于KB液中室溫下（15～25℃）靜置0.5～1h后復鈣，然后進行實驗。

1.4 玻璃微電極的制備 1.20mm玻璃微電極，內徑0.9～1.1mm，壁厚 0.10～0.15mm，管長100mm，應用P-97程控水平微電極拉制器（USA）經兩步拉制，調節兩步的時間和速度設置，拉制出左右兩根電極，充灌電極液后，排除尖端氣泡備用。一般尖端電阻為2～4MΩ。

1.5 全細胞膜片鉗記錄 將復鈣的細胞懸液加入細胞池中，并置于倒置顯微鏡工作臺上，待細胞沉底貼壁（5～10min）后，室溫下用臺氏液或L型鈣通道的細胞外液灌流，流速2～4mL/min。將充灌電極內液（L型鈣通道的電極內液）的玻璃微電極安裝在探頭的電極夾持器上。EPC-10double膜片鉗放大器系統通過D/A和A/D轉換卡由計算機控制刺激發放和信號的采集。移動Sutter三維電動顯微操作器將略帶正壓的電極尖端輕壓在橫紋清晰的桿狀細胞上，輕施負壓待吉歐姆封接形成后，正確補償快電容的前提條件下，用驟發較大負壓吸破細胞膜，小心補償慢電容，打開串聯電阻補償，將補償率調至50%～80%左右。全細胞膜片記錄即告形成。

1.6 觀察宣導瀉肺飲含藥血清對大鼠心室肌細胞ICa-L的影響 心肌細胞完成封接破膜補償快慢電容及串聯電阻后，MODE置向VC后進行ICa-L記錄：鉗位電位-40mV，以除極化至0mV，持續200ms的階躍脈沖激活L-型鈣通道 （ICa-L）：以從-30mV至+60mV，階躍 +10mV，脈寬為200ms的命令電壓鉗制記錄峰值工ICa-L的電流-電壓曲線；電流峰值以內向峰電流值與100ms后電流值之差計算。觀察電極外液灌流（對照組）和宣導瀉肺飲含藥血清10%，30%的稀釋血清后電流幅值和門控動力學的影響。用異搏定（維拉帕米）可阻斷此電流，從而證明此電流為ICa-L（Cs+已將K通道阻斷，鉗位于-40mV Na+通道已失活）。

2 結 果

2.1 分離細胞的形態學 ZEISS倒置顯微鏡（Germany）下可見單個心室肌細胞星棒狀或桿狀，細胞膜表面光滑，橫紋清楚且排列整齊。復鈣后部分心肌細胞有自發性收縮，短時間內攣縮，變圓成死亡細胞，而大部分呈靜止狀態可供做實驗使用。獲得60%以上橫紋清晰的桿狀耐鈣活細胞，且可以成活8h以上。

2.2 分離細胞的鈣電流 壓鉗模式下以10mV的步長使心室肌細胞由-40mV的鉗位電位逐步去極化至+50mV，刺激持續250ms，記錄到一個緩慢失活的內向電流，在此條件下，鈉通道和T-型鈣通道幾乎被完全抑制，電極內液中又加入了Cs+，可以消除鉀通道電流的影響。在灌流的外液中加入10mmo1/L的維拉帕米可以幾乎完全阻斷上述的電流，實為慢鈣電流。

2.3 不同濃度宣導瀉肺飲含藥血清對大鼠心室肌細胞鈣通道電流的影響 見表1、圖1。不同濃度的宣導瀉肺飲含藥血清灌流心室肌細胞5min明顯抑制ICa-L。沖洗后可見ICa-L有所恢復，其降低無顯著差異。不同濃度的宣導瀉肺飲含藥血清對心室肌細胞的Ica-L呈濃度依賴性抑制。圖1示不同深度的宣導瀉肺飲含藥血清作用下的ICa-L電流-電壓曲線，可見其形狀未發生明顯改變。

3 討 論

心律失常的發生與心肌電生理特性異常有關，而心肌電生理特性又與心肌細胞上的Ca2+離子通道密切相關[1-3]。目前臨床上使用的抗快速性心律失常西藥有4類，除Ⅱ類屬于β受體阻斷劑以外，其余均作用于不同的離子通道，而產生抗心律失常的作用。目前心血管人工合成藥的研究較多，因此人們已將其注意力轉移到天然藥物和中藥的研究上，且隨著分離技術的發展和提高，抗心律失常中藥的研究已經從復方、單味藥深入到有效的單體成分上[4]，現己發現抗心律失常的中藥單體有十幾種，如：黃連素，鉤藤堿，紅花黃素，關附甲素，人參三醇等[5-8]，從目前對它們抗心律失常的電生理的研究來看，大多數是屬于Ⅲ類抗心律失常藥。

表1 不同濃度宣導瀉肺飲含藥血清對不同電壓下大鼠心室肌細胞 ICa-L（pA）的影響 (n=6，±s）

表1 不同濃度宣導瀉肺飲含藥血清對不同電壓下大鼠心室肌細胞 ICa-L（pA）的影響 (n=6，±s）

與對照組、沖洗后比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

電壓（mV）-30-20對照組21.50±9.40 127.10±36.50 10%含藥血清組13.30±4.30**101.90±44.50 30%含藥血清組10.10±2.90**89.60±27.20**沖洗后19.20±3.90 123.30±46.70-10 299.70±89.90 227.10±87.10 182.10±45.70** 270.00±84.80 0 586.50±111.30 449.40±107.70 311.10±99.70** 544.00±136.90 10 631.30±156.50 537.70±135.10* 36.00±123.70** 610.20±135.80 20 580.90±121.30 481.60±97.70* 317.10±117.10** 551.40±136.50 30 475.30±139.30 390.30±95.10* 226.10±67.30** 446.00±95.80 40 276.70±36.50 201.10±44.50** 140.10±37.10** 223.10±46.70 50 127.10±36.50 101.90±44.50 63.70±5.50** 117.30±46.70 6016.70±7.1012.70±6.209.20±2.80**14.50±5.70

圖1 不同濃度宣導瀉肺飲含藥血清作用下Ica-L的電流-電壓曲線

眾所周知，動作電位的去極化（0期）是與Na+離子通道開放，Na+內流有關；而復極化均與 K+，Ca2+通道有關，現在發現與心肌復極化有關的K+電流有多種，主要有一過性外向鉀電流、內向整流鉀電流和延遲整流鉀電流。有報道認為，內向整流鉀電流主要作用維持心肌細胞的靜息電位和動作電位3期快速復極過程，延遲整流鉀電流則參與整個復極過程并與ICa一起共同維持動作電位復極化2期，而細胞內鈣超載是心肌缺血/再灌注損傷的中心環節，對細胞的損傷起關鍵作用。

宣導瀉肺飲是筆者課題組在葉天士經驗基礎上，加以化裁用以治療心悸的經驗方，方中主要藥物組成為：葶藶子、桑白皮、杏仁、厚樸、陳皮、萊菔子、豬苓、澤瀉、川木通、當歸。本方用藥，三焦兼顧，而以葶藶子、桑白皮開宣上焦為君，萊菔子、豬苓分入中下二焦為臣，余藥助君臣之力為佐。諸藥合用，宣上和中滲下，使上宣中和下達，三焦氣機通暢，共奏宣導三焦，瀉肺豁痰，活血利水之功。藥理研究發現宣導瀉肺飲組方中主藥葶藶子有強心作用，使家兔心電圖見有P波變低和洋地黃型的雙向T波等[9]。

本實驗利用細胞膜鉗技術，進一步在分子水平研究宣導瀉肺飲對Ca2+通道的影響，結果表明，宣導瀉肺飲對Ca2+通道有抑制作用。在分離的單個心室肌細胞上所記錄到的Ca2+電流其特性，具有電壓依賴性，在去極化時被激活。因此推測宣導瀉肺飲可能是通過抑制慢鈣通道來縮短APD，APD50，從而縮短有效不應期，發揮其抗心律失常的作用。

本研究證明宣導瀉肺飲可抑制電壓門控性鈣通道的外鈣內流和減少肌漿網的內鈣釋放，從而減少大鼠心室肌細胞[Ca2+]i，對心室肌細胞產生保護作用。

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