抗骨增生片對兔骨關節炎滑膜病理形態及uPA、uPAR表達的影響*

尹學永 谷寧飛 王志文 馬敬習 于 楊

1河北省秦皇島市第二醫院（河北秦皇島066600）2天津中醫藥大學（天津300193）3河北省安國市醫院（河北安國071200）4河北聯合大學中醫學院（河北唐山063000）

抗骨增生片具有補腎、活血、止痛之功效，臨床應用治療骨關節炎取得滿意療效。此研究通過建立兔實驗性膝骨關節炎模型，觀察抗骨增生片對其滑膜病理組織形態及尿激酶型纖溶蛋白酶原激活物（uPA）及其受體（uPAR）表達的影響，以探討該藥治療膝骨關節炎是否與減輕滑膜損害、降低二者的表達有關。

1 材料與方法

1.1 藥物與動物 抗骨增生片：通化華夏藥業有限公司生產；成分：熟地黃、鹿銜草、骨碎補（燙）、淫羊藿、肉蓯蓉、雞血藤、萊菔子（炒）；批準文號為國藥準字Z22023683。雄性日本大耳白兔30只，體質量（2.50±0.150）kg。 于室溫分籠飼養，按頓供給標準飼料（由華北煤炭醫學院實驗動物中心提供），自由活動、飲水。

1.2 試劑與儀器 木瓜蛋白酶購自天津市諾奧科技發展有限公司，活力200萬U/g；uPA、uPAR免疫組化試劑盒均購自武漢博士德試劑公司；石蠟組織切片機，天津天利航空機電有限公司；光學顯微鏡，BX50型，日本OLYMPUS公司生產。

1.3 分組與造模 健康雄性日本大耳白兔30只，適應性喂養1周后隨機分為正常對照組、模型對照組，抗骨增生片組。每組各10只。參照文獻[1]方法，用氯氨酮肌肉注射（10mg/kg）麻醉動物后，模型對照組和抗骨增生片組均于右膝關節處剔毛，碘伏消毒，將關節輕彎，經髕腱內側進針，關節腔內注射1.6%木瓜蛋白酶生理鹽水溶液0.5mL，隔3d注射1次，共注射3次。期間動物用標準飼料正常飼養。

1.4 給藥方法 造模結束后24h開始給藥?？构窃錾M按成人每日每千克體質量用藥量的6倍劑量作為大耳白兔的等效劑量[2]（抗骨增生片 0.36g/kg），藥物溶于 10mL 生理鹽水中灌胃，每日1次；正常對照組和模型對照組灌胃等量生理鹽水。給藥4周。

1.5 標本采集及檢測 于末次給藥后24h以氣栓法處死動物，沿右側膝關節正中縱行切開皮膚直至暴露出以膝關節為中心約3cm×3cm的區域，以齒鑷提起髕骨，沿髕骨上緣約0.3～0.4cm處向下切割直至髕骨，再分別沿髕骨兩側向下分離至脛骨，此時即打開了右側膝關節腔，可見由髕骨下緣向上延續的滑膜組織。完整剝離滑膜組織，最后以眼科鑷輕輕夾住其游離端，用刀片完整切下。標本用新鮮配制10%中性甲醛溶液固定，石蠟包埋，切片。每個標本制作3張切片，一張進行蘇木素和伊紅染色光鏡觀察，做病理形態學分析；另兩張作免疫組化測定。以滑膜組織病理形態學積分，uPA、uPAR陽性細胞個數對數據進行量化。

1.6 統計學處理 應用SPSS 11.5統計軟件。計量資料以（±s）表示。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 光鏡下滑膜組織形態 正常對照組：滑膜細胞單層，形態扁平，薄膜樣，半透明，無血管增生，無纖維化，無乳頭狀增生，偶見炎細胞、巨噬細胞。模型對照組：滑膜組織明顯充血、水腫，表現為小血管增多、擴張，充滿紅細胞，間質疏松，有較多炎性細胞浸潤、纖維細胞增生，有血管翳形成，滑膜細胞增生成多層，呈乳頭狀，其下方出現明顯的巨噬細胞樣肉芽腫性病變?？构窃錾M：滑膜腫脹、充血程度及較模型對照組明顯減輕，滑膜細胞增生亦較模型對照組輕，未見明顯炎細胞浸潤及血管增生，巨噬細胞樣肉芽腫性病變及間質纖維化不明顯。

2.2 滑膜病理積分 參照巫桁錁等[3]滑膜病理評分標準對各組兔關節進行評分。抗骨增生片組及模型對照組滑膜組織病理形態各單項積分及總積分高于正常對照組（P＜0.01），抗骨增生片組滑膜組織病理形態各單項積分及總積分明顯低于模型對照組（P＜0.05）。 結果見表 1 。

表1 各組滑膜病理形態單項積分比較 （分，±s）

表1 各組滑膜病理形態單項積分比較 （分，±s）

與正常對照組比較,▲P＜0.01;與模型對照組比較,△P＜0.05。下同。

組別 n 炎性細胞浸潤正常對照組 10 0.45±0.28模型對照組 10 2.35±0.63▲抗骨增生片組 10 2.30±0.48▲△纖維組織增生0.75±0.68 2.60±0.40▲2.25±0.68▲△滑膜組織增生 巨噬細胞增生 總積分0.40±0.39 0.55±0.50 2.95±1.42 2.50±0.41▲ 2.55±0.50▲ 10.40±0.77▲2.20±0.42▲△ 2.10±0.52▲△ 9.20±1.06▲△

2.2 各組uPA、uPAR陽性細胞表達比較 各組的滑膜襯里層細胞、滑膜下層單核細胞、巨噬細胞樣細胞、多型核白細胞以及內皮細胞均出現uPA和uPAR的表達，在抗骨增生片組及模型對照組滑膜組織中的表達強度高于正常對照組（P＜0.01），抗骨增生片組滑膜組織中的表達強度明顯低于模型對照組 （P＜0.05）。 結果見表2。

3 討 論

盡管骨關節炎（OA）病因復雜并存在爭議，但總伴有不同程度的滑膜炎癥。在諸多因素引起的軟骨退變過程中，滑膜的炎性介入是加速軟骨退變且誘發臨床癥狀的重要因素之一。有研究證明，膝骨關節炎可表現為滑膜水腫、血管擴張，滑膜細胞分泌異常旺盛、功能活躍，關節腔內積液增多，壓力增大，使循環受阻，局部代謝產物堆積[4]。如此循環往復，致使滑膜逐漸增厚、纖維化、粘連，滑膜中uPA，uPAR增高，加劇滑膜炎癥，并可直接釋放入關節液中，與各種細胞因子間相互作用，使得滑膜炎癥遷延，并激活軟骨中的纖溶酶原，被激活的纖溶酶可引起關節軟骨基質的降解，導致關節軟骨的進行性破壞[5-6]，從而形成惡性循環，影響膝關節的正常活動，加重OA癥狀。

表2 各組uPA、uPAR陽性細胞表達比較 （±s）

表2 各組uPA、uPAR陽性細胞表達比較 （±s）

組 別 n uPA uPAR正常對照組 10 2.60±1.26 2.40±1.35▲模型對照組 10 33.30±4.22▲ 33.5±5.32▲抗骨增生片組 10 29.10±4.93▲△ 24.6±5.64▲△

OA屬于中醫學“骨痹”、“痛痹”等范疇，其發病與年老肝腎虧虛、外感風寒濕邪密切相關，最終導致關節氣血、痰瘀凝滯而發病，屬本虛標實之證。肝腎虧虛、瘀血阻滯是骨痹發生的病機關鍵?？构窃錾M方精煉、簡而力專。方中熟地黃、骨碎補、淫羊藿、肉蓯蓉具補腎益精、填髓壯骨之效，雞血藤、鹿銜草、萊菔子具理氣活血、祛風除濕之功，組方切合骨痹腎虛、血瘀之病機，臨床應用能有效緩解膝骨關節炎疼痛、晨僵，消除關節腫脹，恢復關節功能，延緩病情的進展。

實驗結果顯示，經木瓜蛋白酶關節腔注射造模后滑膜組織明顯充血、水腫，均出現了病理性損壞?？构窃錾o藥后滑膜充血、肥厚減輕，病理積分與模型組比較明顯下降，具有顯著差異。治療后滑膜中uPA、uPAR的陽性表達降低。

綜上分析，抗骨增生片治療OA可能與以下機制有關：通過抑制滑膜炎癥，減少滑液分泌量，從而減少滑膜細胞炎性細胞因子的分泌，減輕其對關節軟骨的破壞；該藥的有效成分與uPA上的酶結合位點相結合而降低其表達，或能夠直接抑制滑膜細胞合成分泌uPA和uPAR而使其含量下降，降低關節軟骨基質的降解；改善膝關節組織血液循環并清除炎性細胞對軟骨的損傷等因素而改善關節軟骨正常的內環境，促進滑膜細胞及細胞外基質的修復，起到防治OA，延緩軟骨退行性改變的作用。

[1]Kitoh Y，Katsuramaki T，Tanaka H，etal.Effect of SL-1010 （Sodium hyaluronatewith highmolecularweight）on experimentalosteoarthritis induced by intra-articularly，applied papain in rabbits [J].Folia pharmacol japon，1992，100（1）： 67-76.

[2]孫敬方.動物實驗方法學[M].北京：人民衛生出版社，2002：357.

[3]巫桁錁，李榮亨，鐘玉.復元膠囊對兔膝骨關節炎滑膜形態影響的實驗研究[J].中國中醫急癥，2010，19（5）：823.

[4]左曉霞，陶立堅，高潔生主譯.凱利風濕病學[M].7版.北京：人民衛生出版社，2006：1276.

[5]Li MQ，Shi CH，Li KX，et al.Expression of uPA，uPAR，tPA in osteoarthritis synovialmembrane and the significance[J].The Orthopedic JournalofChina，2004，12（21）：1686-1688.

[6]王萬春，王躍，孫材江.骨關節炎滑膜中尿激酶型纖溶酶原激活物及其受體蛋白的表達[J].湖南醫科大學學報，2001，26（3）：257-260.