關節炎大鼠模型血清中IL-4、IL-10表達的檢測

范雪亮 肖金魚

解放軍第二五一醫院（河北張家口075000）

類風濕關節炎（RA）是以四肢小關節滑膜慢性炎癥為特征，伴有滑膜纖維母細胞增生，大量淋巴細胞、巨噬細胞、漿細胞浸潤的一種常見的自身免疫性疾病。目前RA的發病機制尚未完全闡明，但其典型的病理學特征為滑膜組織異常增生，其中細胞因子網絡失調持續作用于病變部位是導致病變侵蝕進展的主要原因之一。細胞因子通過介導細胞與細胞之間的相互作用引起組織損傷酶的釋放，從而導致關節損傷，是RA炎癥和關節損傷的重要介質。在諸多參與RA炎癥反應的細胞因子中白細胞介素-4（IL-4）和白細胞介素-10（IL-10）是少有的抑制炎癥因子，在RA類風濕關節炎發病過程中受到抑制[1]。本實驗酶聯免疫吸附（ELISA）技術檢測佐劑性關節炎（AA）大鼠模型血清中IL-4和IL-10，以探討其在動物模型中的表達特點。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 20只wistar大鼠，雌雄各半，體質量（150±30）g，合格證號：0172808，購于河北北方學院動物室；飼養于SPF動物實驗室，全年溫度21～24℃，相對濕度40%～67%。

1.2 試劑與儀器 弗氏完全佐劑購于美國Sigma公司；大鼠IL-4和IL-10 ELISA試劑盒均為美國Headquarters公司產品。TDL80-2B離心機，EL301strip reader酶標儀購于自美國Bio Tek公司。756MC型紫外可見分光光度計，上海精密科學儀器有限公司產品。

1.3 分組與造模 30只wistar大鼠隨機分成對照組（10只）、模型組（20只）。造模根據文獻[3]方法加以改進，正常條件飼養10d后，將弗氏完全佐劑搖勻后，按0.1mL/只注于模型組大鼠右后肢足跖內造模。

1.4 病理組織學檢查 造模30d后取模型組5只大鼠的踝關節，經固定、脫鈣石蠟包埋、切片后行蘇木精-伊紅（HE）染色。光鏡下觀察局部組織病理學變化。

1.5 影像學檢查 造模20d后取5只大鼠（用苦味酸做標記），每只大鼠腹腔注射10%水合氯醛3.5mL/kg麻醉，行大鼠四肢關節X線攝片，觀察關節破壞情況。30d后在取相同大鼠重復操作，觀察關節破環情況。

1.6 模型評價 大鼠生長情況：普通實驗天平稱體質量，造模前稱1次，造模后每兩日測量1次，記錄動物生長情況。同時仔細觀察動物的毛色、精神狀態及關節癥狀的變化。大鼠關節足腫脹：注射弗氏完全佐劑后，用容積法排水法測量雙后肢的足腫脹度。造模前觀察1次，后每周觀察1次，觀察足爪腫脹情況。同時對其他3只足爪炎癥進行評分。采用4分制的評分標準，每只大鼠的最高分為16分，記錄并比較20d時，對照組和造模組關節炎指數和雙后肢足腫脹度平均值差異。IL-4、IL-10含量：用10%水合氯醛（3.5mL/kg）麻醉大鼠，開胸使心臟暴露，進行心臟取血，全血2500r/min離心20min，取血清-20℃保存備用。檢測IL-4、IL-10，具體操作按ELISA試劑盒說明進行。

2 結 果

2.1 一般情況 模型組大鼠體質量明顯減輕，關節紅、腫，以對稱性后肢關節為主，累及踝關節、膝關節、趾間關節等。20d左右出現第1個炎癥高峰，然后紅腫有一定程度消退；30d左右達到第2個高峰，進入慢性期，紅腫逐漸消退逐漸出現關節強直、畸形以至功能障礙，表明慢性、對稱性、多發性關節炎發生。

2.2 大鼠模型雙后肢足腫脹度 見表1。實驗第14日，大鼠關節開始出現腫脹，而后足首先出現紅腫，后逐漸延伸至前足并日趨嚴重，20d腫脹達到最高值后逐漸減輕，模型組與對照組大鼠比較差異有統計學意義（P＜0.05）。

表1 兩組組大鼠雙后肢足腫脹度比較 （±s）

表1 兩組組大鼠雙后肢足腫脹度比較 （±s）

與對照組比較，*P＜0.05。 下同。

組 別 n 關節炎指數 關節體積（cm3）對照組 10 0.90±0.73 7.15±0.23模型組 10 7.29±1.82* 13.81±1.63*

2.3 大鼠模型雙后肢X線表現 X線片顯示模型組大鼠以雙后肢改變為主，20d時隱約可見骨質疏松，關節間隙模糊，30d時X線片可見明確的關節間隙模糊、變窄。 而對照組大鼠雙踝關節同時點比較，變化不大，無明顯骨質疏松、關節間隙清晰、未見骨質破壞。

2.4 大鼠模型炎性足爪組織病理學改變 造模30d后，模型組大鼠節腔滑膜層次增多可達6～8層，甚至10余層，且排列不規整，滑膜內有大量炎性細胞浸潤，以單核細胞和淋巴細胞為主，且在關節軟骨附近有血管翳形成，引起關節軟骨和骨組織破壞。

2.5 大鼠模型外周血IL-4和IL-10的表達 見表2。模型組IL-4和IL-10水平較對照組均明顯降低，兩組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。

表2 兩組大鼠炎性細胞因子水平比較 （ng/L，±s）

表2 兩組大鼠炎性細胞因子水平比較 （ng/L，±s）

組別 n IL-4 IL-10對照組 10 124.82±16.77 59.00±16.85*模型組 10 67.00±8.55* 29.11±27.59*

3 討 論

IL-4能調節多種不同類型細胞的活性，抑制TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8等炎癥因子的活性，控制炎癥反應。IL-4通過提高mRNA的降解率來抑制促炎性細胞因子的合成；IL-4還有保護軟骨和關節下骨及其他關節組織完整性的作用，主要通過減輕由INF、IL-1和LPS造成的蛋白多糖的破壞而起作用[2]。另外，IL-4能上調IL-1Ra的產生，刺激單核細胞/巨噬細胞和中性粒細胞產生可溶性Ⅱ型IL-1R、可溶性 TNF；同時IL-4可減少單核細胞MHC分子和共刺激分子的表達、NO的合成、PGE2的產生。IL-4能使Th1/Th2型細胞發生轉移和引導B細胞產生IgG1、IgG4、IgE 抗體，還可協同 IL-10 抑制 Th1 細胞反應[5]。 這些現象表明，IL-4在RA的發病過程中通過抑制細胞反應和抑制促炎性細胞因子而起抗炎作用。IL-10通過抑制核因子κB進而抑制 Th1細胞產生 TNF-α、IL-2、IFN-γ；IL-10可降低單核細胞HLA-DR抗原和 B7等協同刺激分子的表達，抑制Th1細胞介導的淋巴細胞活性；抑制NO合成和PGE2產生[6]。在正常情況下，炎癥因子和抗炎因子處于一個平衡狀態，如有外界原因使抗炎因子的分泌減少，打破這種平衡，則會引發類風濕關節炎，所以一些能夠促進抗炎因子分泌的藥物也成了研究熱點。本實驗通過對大鼠AA模型的制備及對對照組和模型組大鼠關節炎癥積分、影像學、病理學等相關指標的評估，進一步探討了IL-4和IL-10在AA模型中的表達特點。結果表明IL-4和IL-10大鼠模型中的表達受到了抑制，這與其在RA患者中的相關表達特點相類似。作為在RA中大量存在的T細胞來源的細胞因子IL-4和IL-10可能成為評價RA病情和治療療效的兩個最重要免疫學指標?？傊?，對IL-4和IL-10的深入研究必將有助于對RA發生機制的進一步認識，合理地評價RA的病情進展，為RA治療，包括藥物及免疫治療提供更加科學的實驗依據。

[1]劉慧招，沈敬華.類風濕關節炎免疫機制的研究進展[J].內蒙古醫學雜志，2008，40（3）：327-329.

[2]Wirjatijasa F，Dehghani F，Blaheta R A，et al.Interleukin-4，interleukin-10，and interleukin-1-receptor antagonist but not transforming growth factor-beta induce ramification and reduce adhesionmoleculeexpressionof ratmicroglialcells[J].JNeurosciRes，2002，68（5）：579-587.

[3]Vanroom JAG，Lafeber FP JG，Bijlsma JW J.synergistic activety of interleukin-4 and interleukin-10 in suppression of inflammation and joint destruction in rheumatoid arthritis[J].Arthritis Rheum，2001，44（10）：3-12.

[4]Fermandes JC，Martel-pelletier J，Pelletier JP.The role of cytokines in osteoarthritis pathophysiology [J].Biorheology，2002，39（12）：237-246.