IFN-λ對人食管癌細胞增殖的抑制作用及機制

趙 鑫，齊義新，魏 林，胡 潔，趙丹娜，卜友泉，李全海，，張 峰*

(1河北醫(yī)科大學第一醫(yī)院，石家莊050031;2河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院;3河北醫(yī)科大學免疫學教研室;4重慶醫(yī)科大學分子醫(yī)學與腫瘤研究中心)

干擾素lambda(IFN-λ)是一種新發(fā)現(xiàn)的Ⅲ型干擾素，相關研究顯示，其可誘導抗病毒基因和MHC-I類分子表達升高［1，2］，具有抑制結(jié)腸癌細胞或神經(jīng)內(nèi)分泌癌變細胞增殖的生物學活性［3，4］;但其對人食管癌細胞增殖的影響鮮見報道。2011年1～8月，我們觀察了人食管癌細胞 IFN-λ受體表達及IFN-λ的體外抗腫瘤活性，并對其可能機制進行初步探討。

1 材料與方法

1.1 材料 人食管癌細胞株 TE1、TE11、YES4、YES5、YES6和 T.Tn均由日本千葉縣癌癥研究中心細胞治療研究室惠贈。胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)基購自美國 GIBCO公司;重組 IFN-λ1購自 R＆D公司;IFN-λ購自Santa Cruz公司;流式細胞儀為美國BD公司產(chǎn)品;TrizolTM Reagent核酸分離試劑盒購自美國GIBCO公司;逆轉(zhuǎn)錄和PCR試劑盒購自大連TaKaRa公司;二苯基溴化四氮唑藍(MTT)購自Sigma公司;IL-28α、IL-10β引物由上海生工生物工程公司合成。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及IFN-受體復合體表達檢測 取TE1、TE11、YES4、YES5、YES6和 T.Tn細胞，RP-MI1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)培養(yǎng)，至對數(shù)生長期后裂解細胞提取RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用相應引物經(jīng)PCR擴增目的基因。PCR法檢測IFN-受體復合體表達。

1.2.2 細胞干預及增殖抑制率測定 將6種細胞株分別接種于96孔板(1×103個/100 μl培養(yǎng)液/孔)，分別添加重組IFN-λ1及IFN-λ，使之終濃度為100 ng/ml。每組設3個平行樣本并設不加IFN的對照孔。細胞培養(yǎng)72 h后加入MTT 20 μl，孵育4 h并棄去孔中液體，加入二甲基亞砜(DMSO)溶解結(jié)晶物，于490 nm波長處讀取吸光度值(A值)。以不添加IFN的對照組的活力為100%，計算細胞生長抑制率［=(1－細胞因子處理細胞A490/對照細胞A490)×100%］。

1.2.3 細胞干預及活細胞計數(shù) 分別將6種食管癌細胞株接種于12孔板中(2×104個/孔)，并添加100 ng/ml重組IFN-λ1(干預細胞)。每組設3個平行樣本并設不加IFN-λ1的對照孔(對照細胞)。培養(yǎng)24、72及120 h后分別收取細胞做胎盤藍染色后計數(shù)活細胞。

1.2.4 細胞干預及細胞周期測定 采用重組IFN-λ1(終濃度為100 ng/ml)分別干預各細胞株培養(yǎng)至對數(shù)生長期3 d后，常規(guī)消化并收集，80%乙醇固定，－20℃過夜，PBS洗滌，加入 Rnase A(50 μg/ml)，37 ℃孵育30min，加入 PI(50 μg/ml)染液，4℃避光染色30min后上機分析;以無重組IFN-λ1為陰性對照細胞。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS10.0軟件行統(tǒng)計學處理。正態(tài)分布數(shù)據(jù)以mean±SD表示，采用具有一個重復測量的兩因素設計一元定量資料方差分析比較組間差異。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 細胞IFN-λ受體復合體表達 6種食管癌細胞分別經(jīng)裂解提取 RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，IL-28Rα、IL-10Rβ的基因編碼區(qū)經(jīng)PCR擴增，得到預期PCR產(chǎn)物(IL-28Rα為370 bp;IL-10Rβ為412 bp)，即在1%瓊脂糖凝膠電泳后顯現(xiàn)了RT-PCR產(chǎn)物與預期大小相符片段。表明各食管癌細胞均表達IL-28α和IL-10β基因，即IFN-λ受體復合體。

2.2 細胞增殖抑制率 見表1。由表1可見，TE11、YES5 和 T.Tn 細胞對 IFN-λ1 和 IFN-λ 抗增殖抑制活性敏感(敏感細胞)，TE1、YES4和YES6細胞不敏感(不敏感細胞)。

2.3 活細胞計數(shù) 見表2。與對照細胞比較，3株不敏感細胞IFN-λ1干預24、72和120 h活細胞數(shù)無明顯變化。3株敏感細胞IFN-λ1干預后72 h和120 h活細胞數(shù)明顯減少，IFN-λ對敏感細胞有抗增殖活性，且抗增殖活性在72 h后顯示，干預120 h活性最強。見表2。

表1 IFN-λ1及IFN-λ對6種食管癌細胞的增殖抑制率(%，±s)

表1 IFN-λ1及IFN-λ對6種食管癌細胞的增殖抑制率(%，±s)

注:與 TE1、YES4及 YES6 細胞比較，*P ＜0.05

細胞 IFN-λ1處理 IFN-λ 處理TE1 4.3 ±1.3 7.3 ±0.5 TE11 57.8 ±2.7* 64.2 ±1.5*YES4 16.0 ±3.7 4.5 ±2.8 YES5 61.3 ±1.2* 43.5 ±2.1*YES6 2.1 ±0.7 2.0 ±0.5 T.Tn 51.0 ±2.6* 10.9 ±2.1*

表2 IFN-λ1干預后3株敏感細胞的活細胞數(shù)(×104個，±s)

表2 IFN-λ1干預后3株敏感細胞的活細胞數(shù)(×104個，±s)

注:與對照細胞比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

細胞 干預細胞 對照細胞TE11 24 h 2.3 ±0.2 2.9 ±0.1 72 h 3.5 ±0.1* 7.4 ±0.3 120 h 4.7 ±0.1＊＊ 15.3 ±1.0 YES5 24 h 2.3 ±0.1 2.5 ±0.1 72 h 4.0 ±0.1* 10.0 ±0.1 120 h 4.9 ±0.8＊＊ 16.7 ±0.7 T.Tn 24 h 5.7 ±0.3 4.4 ±0.1 72 h 6.9 ±1.8* 15.8 ±1.9 120 h 7.6 ±2.6＊＊23.9 ±3.3

2.4 細胞周期分布 3株不敏感細胞IFN-λ1干預后細胞周期無明顯變化。3株敏感細胞IFN-λIFN-λ1干預后細胞周期變化見表3。由表3可見，IFN-λIFN-λ1干預24和48 h可將 TE11細胞阻滯于G1期，可將YES5和T.Tn細胞上調(diào)至sub-G1期。

3 討論

IFN-λ 的家族成員包括 IFN-λ1、IFN-λ2 和 IFN-λ3，也被命名為 IL29、IL28A 和 IL28B;IFN-λ 受體為異源二聚體復合物，由IL-28受體 α(IL-28Rα)和IL-10 受體 β(IL-10Rβ)共同組成［1，2］。前期文獻報道，IFN-λ1可通過細胞表面的相應受體上調(diào)抗病毒、抗腫瘤相關基因、相關分子的表達［1，2］;同時對一些癌細胞株可發(fā)揮抗增殖生物學活性［3，4］。本研究結(jié)果顯示，IFN-λ1對6種食管癌細胞生長增殖有著不同程度的抑制活性，這種不同程度的敏感性與IFN-λ在各細胞中誘導的抗增殖敏感性相一致，即對IFN-λ1抗增殖活性敏感的細胞對IFN-λ引起的抗增殖活性同樣敏感;而對IFN-λ1抗增殖抵抗的細胞對IFN-λ引起的抗增殖活性呈抵抗狀態(tài)，此數(shù)據(jù)在一定程度上表明IFN-λ1抗瘤活性的信號通路與IFN-λ相似，兩種干擾素的抗增殖逃逸機制也可能類似［5，6］，此為進一步研究 IFN-λ 的抗增殖活化機制和逃逸機制提供了重要思路。由于IFN-λ誘導的抗增殖機制為細胞周期抑制和凋亡，故IFN-λ也極有可能通過細胞周期抑制和凋亡來發(fā)揮其抗增殖作用;而在對IFN-λ抗增殖抵制的細胞系中可能由于信號轉(zhuǎn)導分子或復合體(如ISGF3復合體或其組成分子)缺失導致了其抗增殖逃逸。在TE11細胞中，IFN-λ1使細胞停滯在G1期是在其作用后的24 h開始并延續(xù)到細胞因子作用后的72 h，表明IFN-λ可通過細胞內(nèi)信號活化迅速誘導增殖抑制，而這種抑制具有可延續(xù)性;與G1期阻滯相關分子如p21和Rb也可能被IFN-λ1激活或上調(diào)。在YES5和T.Tn細胞中IFN-λ1在其作用后的72 h才可明顯上調(diào)sub-G1期，此結(jié)果表明IFN-λ不能直接通過活化細胞內(nèi)信號誘導凋亡，而是通過誘導其他相關因子表達后才導致細胞凋亡;另外在IFN-λ在誘導凋亡的過程中，是否具有Caspase依賴性以及內(nèi)外源性凋亡機制亦待進一步研究。

表3 IFN-λ1對3株敏感細胞細胞周期的影響(%，±s)

表3 IFN-λ1對3株敏感細胞細胞周期的影響(%，±s)

注:與對照細胞比較，*P ＜0.05

細胞 sub-G1期 G0/G1期 S期 G2/M期TE11 24 h干預細胞 1.9 ±0.4 59.1 ±3.1* 17.7 ±1.0 21.7 ±2.1對照細胞 1.3 ±0.3 48.5 ±2.2 19.8 ±1.3 30.6 ±1.1 48 h干預細胞 2.5 ±0.2 59.3 ±0.9* 18.9 ±1.7 20.1 ±3.2對照細胞 3.2 ±0.4 44.8 ±2.1 25.9 ±2.1 26.9 ±3.1 72 h干預細胞 3.3 ±0.1 60.1 ±4.7* 19.9 ±1.8 17.2 ±1.9對照細胞 4.1 ±0.7 45.3 ±5.1 24.8 ±2.5 26.5 ±2.0 YES5 24 h干預細胞 7.5 ±1.2 50.1 ±2.4 20.9 ±0.1 21.8 ±1.9對照細胞 4.3 ±0.1 52.7 ±0.5 19.8 ±0.6 23.7 ±1.1 48 h干預細胞 13.9 ±2.0 46.2 ±2.6 14.3 ±1.9 25.8 ±3.1對照細胞 9.1 ±1.7 53.4 ±2.8 14.4 ±0.5 23.1 ±1.0 72 h干預細胞 17.6 ±1.9* 41.0 ±1.0 20.9 ±1.4 21.0 ±0.5對照細胞 9.3 ±0.5 49.2 ±1.3 20.7 ±0.2 21.3 ±0.6 T.Tn 24 h干預細胞 3.5 ±0.8 59.0 ±1.7 17.4 ±0.6 19.5 ±1.1對照細胞 3.0 ±0.5 54.2 ±1.3 20.5 ±0.5 22.8 ±0.5 48 h干預細胞 5.3 ±1.1 61.2 ±2.0 19.8 ±0.7 14.2 ±0.4對照細胞 2.6 ±0.5 62.6 ±2.1 17.1 ±0.8 18.1 ±0.9 72 h干預細胞 14.0 ±1.1* 47.3 ±0.7 21.3 ±1.0 17.8 ±0.9對照細胞2.5 ±0.5 70.8 ±0.1 11.7 ±0.1 15.2 ±0.3

此外，即使在增殖抑制敏感的食管癌細胞系中，IFN-λ誘導的抗增殖機制是不同的，如在TE11細胞中IFN-λ1使細胞停滯在 G1期，而在 YES5和 T.Tn細胞中IFN-λ1可上調(diào)sub-G1期。表明IFN-λ可誘導G1期細胞周期阻滯和凋亡，但不同增殖抑制敏感的食管癌細胞系中的IFN-λ誘導抗增殖通路不同。探討IFN-λ的作用機制和信號通路將是今后的研究重點。

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