心房鈉尿肽對力竭小鼠腎臟的抗氧化作用及其機制探討

孫繼新，洪 蘭，于 麗，李海雁，劉麗萍*

(1延邊大學體育學院體育教育系，吉林延吉133002;2延邊大學醫學部)

心房鈉尿肽(ANP)于1981年由 De等［1］在心房提取物中被發現，目前其作為一種快速反應型激素的抗氧化作用引起臨床的廣泛關注。研究發現，ANP參與了心力衰竭時的抗氧化過程，具有減輕心力衰竭氧化損傷的作用［2］;對乳鼠心肌細胞具有保護作用［3］。我們前期研究發現，ANP對力竭小鼠骨骼肌具有抗氧化作用。2010年10月～2011年5月，我們觀察了ANP對力竭小鼠腎臟的抗氧化作用，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 ANP(北京北方生物技術研究所);KT5823(環—磷酸鳥苷依賴性的蛋白激酶阻斷劑;購自美國Sigma公司);丙二醛(MDA)及組織蛋白測試盒(南京建成生物工程研究所);其他試劑均為國產分析純。實驗動物為昆明種小鼠(雄性，體質量18～22 g，由延邊大學醫學部提供，飼養環境溫度為25℃，濕度為70%)。721分光光度計(上海第三儀器廠)。

1.2 實驗方法

1.2.1 力竭小鼠腎組織乳酸(LD)含量測定 將基礎游泳時間的標準差＜10min的18只小鼠隨機分為對照組、應激組和游泳力竭組。對照組直接脫頸處死取腎臟;應激組于(30±2)℃的水中自由活動(20±2)s后取腎臟;力竭組尾部負重(體質量的10%)游泳(水深20cm，水溫等同應激組)，至力竭(在水下10 s仍不能浮出水面)后立即處死腎臟。腎臟取出后用冰冷的生理鹽水沖洗，濾紙吸干稱重，冰浴下制備成5%的勻漿液。采用化學比色法測定各組腎組織勻漿液LD含量，嚴格按照測試盒說明書操作。

1.2.2 血漿ANP水平測定 各組均于取腎臟同時斷頭取血，EDTA抗凝，1 500 r/min離心10min取血漿;放射免疫法［4］測定ANP水平。

1.2.3 ANP對H2O2誘導后腎組織MDA含量的影響 另取24只小鼠脫頸處死，立即取出腎臟，制備成30%的腎臟組織勻漿液分裝，分為對照組、H2O2組、ANP 組、KT5823 組，每管 200 μl;所有試管均置于37℃恒溫水浴中，H2O2反應濃度為0.5 mol/L;ANP最終反應濃度為1.31 ng/ml;KT5823反應濃度為10－5mol/L。按以下步驟操作:①KT5823組加入20 μl的KT5823;其它試管均加等量生理鹽水，震蕩恒溫水浴中孵育15min;②ANP組和KT5823組分別加入ANP 20 μl，其它試管均加等量生理鹽水，孵育15min;③H2O2組、ANP組、KT5823組分別加入20 μl的 H2O2，對照組給等量生理鹽水，孵育15min。采用比色法測定各組MDA含量，嚴格按測試盒說明書操作。

1.3 統計學方法 采用Prism(3.0版)軟件行統計學處理。計量結果用±s表示，顯著性差異采用單因素方差分析(One-way ANOVA)進行檢驗。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 腎組織乳酸含量及血漿ANP水平 見表1。

表1 各組腎臟組織中LD含量和血漿ANP含量(±s)

表1 各組腎臟組織中LD含量和血漿ANP含量(±s)

注:與對照組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;與應激組比較，#P ＜0.05，##P ＜0.01

組別 n LD(mmol/g prot) ANP(ng/μl)6 0.39 ±0.01 9.49 ±0.70 6 0.43 ±0.02 9.89 ±1.09力竭組 6 0.56 ±0.04＊＊# 13.15 ±1.65*##對照組應激組

2.2 ANP對H2O2作用后腎組織MDA含量的影響 見表2。由表2可見，H2O2組MDA含量明顯高于對照組，說明H2O2已導致腎臟組織損傷;ANP組MDA含量明顯低于對照組，ANP有明顯的抗氧化作用;KT5823組MDA含量明顯升高證實KT5823阻斷了ANP的抗氧化作用。

表2 ANP對H2O2作用后腎臟MDA含量的影響(±s)

表2 ANP對H2O2作用后腎臟MDA含量的影響(±s)

注:與對照組比較，*P ＜0.01;與 H2O2組比較，#P ＜0.001;與ANP組比較，△P＜0.001

組別 MDA含量(nmol/mg prot)H2O2組 11.20 ±0.71*6.67 ±0.17 ANP 組 4.15 ±0.21#KT5823 組 9.28 ±1.35△對照組

3 討論

近年來，ANP的抗氧化作用逐漸成為研究熱點。Fürst等［5］研究結果表明，ANP 通過激活 Rho GTP酶家族成員(Rac1)、NADPH氧化酶(Nox)及其類似物Nox2來誘導人內皮細胞的蛋白激酶磷酸化，認為ANP參與了氧化應激過程。我們的前期研究表明，外源性ANP對大鼠腎缺血—再灌注損傷具有一定的抗氧化保護作用［6］;以上均是在病理或正常情況下對ANP抗氧化現象進行的初步觀察。另有很多學者觀察到最大負荷強度和力竭運動后正常人和耐力運動員ANP水平均顯著提高;表明心臟內分泌功能對運動訓練具有一定的適應性，但這種代償反應所起的作用及其作用機制的研究鮮有報道。

本研究表明，力竭運動小鼠血漿ANP水平明顯增加，此與其他學者的研究結果吻合［7，8］。為證明其生成的ANP是否具有抗氧化作用，本研究做了H2O2氧化損傷腎臟的離體實驗，結果表明ANP組MDA含量明顯低于對照組，表明ANP對H2O2損傷腎臟具有明顯的保護作用;運動時ANP升高的是一種代償作用，有助于改善和保護力竭運動時腎臟組織的氧化損傷狀況;ANP的這種抗氧化作用也為治療缺血再灌注導致的腎臟組織氧化損傷提供了依據。

以往的研究表明ANP在體內發揮生物學作用時與心臟、血管、中樞神經系統、淋巴組織、生殖器官及腎臟組織等以結合形式存在的A型鈉尿肽受體(NPR-A)結合，在鳥苷酸環化酶的催化下，催化底物GTP生成環一磷酸鳥苷(cGMP)而發揮其舒張血管、降低血壓、利鈉利尿、抑制細胞增殖以及參與脂質代謝等作用［9，10］。因cGMP的下游信號轉導物質是PKG，為了探討運動狀態下ANP生成增多或增加外源性的ANP其抗氧化作用是否亦通過這條信號轉導途徑實現，本研究用PKG阻斷劑KT5823做了預處理，結果發現，KT5823能夠阻斷ANP對氧化損傷腎臟組織的保護作用，說明ANP抗氧化作用是通過增加cGMP依賴性的蛋白激酶途徑實現的。

綜上所述，力竭運動時血漿ANP明顯增加;這種代償反應參與了腎臟組織的氧化保護作用，其作用機制可能是涌過ANP增加使GTP生成cGMP，從而激活PKG信號轉導通路實現的。

［1］de Bold AJ，Borenstein HB，Veress AT，et al.A rapid and potent natriuretic response to intravenous injection of atrial myocardial extracts in rats［J］.Life Sci，1981，28(1):89-94.

［2］Shono M，Yoshimura M，Nakayama M，et al.Predominant Effect of A-Type Natriuretic Peptide on Reduction of Oxidative Stress During the Treatment of Patients With Heart Failure［J］.Circ J，2007，71(7):1040-1046.

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［5］Fürst R，Brueckl C，Kuebler WM，et al.Atrial Natriuretic Peptide Induces Mitogen-Activated Protein Kinase Phosphatase-1 in Human Endothelial Cells via Rac1 and NAD(P)H Oxidase/Nox2-Activation［J］.Circ Res，2005，96(1):43-53.

［6］李英順，申東洙.心房鈉尿肽在大鼠腎缺血再灌注損傷中的體外抗氧化作用研究［J］.中國西部科技，2009，11(8):31-32.

［7］Edwards JG.Swim training increases ventricular atrial natriuretic factor(ANF)gene expression as an early adaptation to chronic exercise［J］.Life Sci，2002，70(23):2753-2768.

［8］Gutkowska J，Paquette A，Wang D，et al.Effect of exercise training on cardiac oxytocin and natriuretic peptide systems in ovariectomized rats［J］.Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol，2007，293(1):R267-R275.

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［10］Lafontan M，Berlan M，Stich V，et al.Recent data on the regulation of lipolysis by catecholamines and natriuretic peptides［J］.Ann Endocrinol，2002，63(2 Pt 1):86-90.