AKT靶向miRNA表達載體的構建及其對胃癌細胞增殖侵襲的影響

熊建光，李湘楚，何小飛，于紅剛

(1咸寧市中心醫院，湖北咸寧437100;2武漢大學人民醫院)

microRNA(miRNA)是近年來發現的一類內源性非編碼單鏈RNA，能通過與靶mRNA特異性堿基互補配對引起靶mRNA降解或抑制其翻譯，達到調控基因表達的目的［1］。miRNA能高效和特異性阻斷靶基因的表達，是繼siRNA之后RNA干擾領域一種重要的研究手段和實驗工具。蛋白激酶B(AKT)是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，PI3K/AKT通路位于多種基因信號通路的核心部位，通過不同機制調節腫瘤細胞生長、增殖等生物學行為，并在腫瘤細胞耐藥性的形成中起重要作用［2］。2010年6月，我們構建了針對AKT的 miRNA真核表達載體，并觀察了其對胃癌BGC823細胞 AKT表達的抑制作用以及對細胞增殖和侵襲能力的影響。現報告如下。

1 材料和方法

1.1 材料 pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR Expression Vector表達載體、大腸桿菌菌株TOP10、LipofectamineTM2000購自Invitrogen公司;小鼠抗人多克隆AKT抗體購自Sigma公司、小鼠抗人β-actin單克隆抗體購自 Santa Cruz公司;Transwell小室購自Millipore公司。

1.2 miRNA表達載體的構建及鑒定 以AKT基因為目的基因，采用Invitrogen公司提供的軟件選擇靶位點并設計pre-miRNA寡核苷酸序列。在無菌EP管中，將合成的AKT miRNA寡核苷酸等量混勻，退火形成雙鏈結構后與線性化空載體pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR Expression Vector連接，然后將連接產物轉化TOP10大腸桿菌，將含有重組體的菌液涂在含壯觀霉素LB平板上，挑選單個陽性克隆進行PCR鑒定，以確定合成的miRNA是否轉入載體質粒。初步鑒定的陽性克隆菌株搖菌過夜，提取陽性菌液質粒送上海英俊生物工程技術服務有限公司進行插入片段測序。

1.3 細胞培養及轉染 人胃癌BGC823細胞于含10%胎牛血清、37℃、5%CO2環境下培養。選擇生長狀態良好的細胞接種于24孔培養板，加入不含雙抗培養基，待細胞生長密度達到70%左右時隨機分為三組:對照組不加任何處理，空載體組加入未轉染的空載體，AKT miRNA組加入AKT miRNA。

1.4 AKT mRNA及蛋白表達檢測 ①AKT mRNA:采用實時定量PCR法。轉染24 h后抽提總RNA，然后反轉錄合成cDNA。將RCR產物從60℃緩慢均勻提升到95℃，溫度每升高0.2℃讀1次熒光值，共70個循環后進行熔解曲線分析。以GAPDH的表達量為參照標準，按照2－△△Ct計算AKT mRNA相對表達量。②AKT蛋白:轉染48 h后提取總蛋白，用8%SDS-PAGE進行凝膠電泳，樣品分離后電轉至PVDF膜，TBS沖洗后室溫封閉2 h，漂洗后加入1∶500鼠抗人AKT一抗，40℃過夜，洗膜后加入1∶2 000羊抗鼠二抗，37℃孵育1 h，洗膜30min后行ECL顯影并壓片，使用Quantity One軟件進行條帶灰度值分析。

1.5 細胞增殖能力檢測 采用MTT法。三組細胞經計數后接種于96孔板，每孔約5×103個細胞，每組設5個復孔。分別于轉染24、48、72 h后每孔加入20 μl MTT溶液(5 mg/ml)，繼續培養4 h后棄上清液，每孔加入150 μl DMSO，振蕩待結晶溶解后，酶標儀檢測吸光度值A。

1.6 細胞侵襲能力測定 行細胞Transwell體外侵襲試驗:選擇孔徑為8 μm的Transwell小室，上、下室間用聚碳酸酯微孔濾膜隔開，上鋪matrigel基底膠膜，上室和下室之間建立起Transwell系統。用無血清RPMI 1640培養基重懸細胞，按每孔500 μl接種于Transwell上室，下室加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培養基作為趨化因子，每種細胞設3個復孔，培養24 h后取出小室，拭去上層基底膜未穿透細胞，4%多聚甲醛固定和吉姆薩染色，光鏡下計算5個視野下侵襲細胞數目，取平均值。

2 結果

2.1 重組體PCR鑒定及測序 凝膠電泳所顯示的條帶約為260 bp，符合目的條帶大小，初步證明premiRNA片段已正確定向插入到載體中。同時測序結果顯示所插入的序列完全正確，表明已成功構建了針對人AKT基因的miRNA表達質粒。48 h后通過熒光顯微鏡觀察細胞，可見BGC823細胞發出綠色熒光，表明細胞中有轉染的外源基因表達，提示質粒轉染成功。

2.2 AKT mRNA和AKT蛋白表達 對照組、空載體組、AKT miRNA組AKT mRNA表達量分別0.87±0.13、0.85 ±0.08、0.12 ±0.04;蛋白表達量分別為3 256±342、3 112±215、387±32。AKT miRNA組AKT mRNA和蛋白表達顯著低于對照組和空載體組(P均＜0.05)，而對照組和空載體組之間則無明顯差異。

2.3 細胞增殖能力 見表1。

表1 各組不同時間點細胞增殖能力比較(A值，±s)

表1 各組不同時間點細胞增殖能力比較(A值，±s)

注:和對照組及空載體組比較，*P＜0.05

24 h 48 h 72 h AKT miRNA 組 0.31 ±0.02 0.53 ±0.05* 0.63 ±0.09組別*空載體組 0.42 ±0.02 1.21 ±0.06 1.58 ±0.12對照組0.43 ±0.02 1.24 ±0.06 1.63 ±0.14

2.4 細胞侵襲能力 轉染48 h后對照組、空載體組、AKT miRNA組發生侵襲細胞數分別為(50.32±5.78)、(54.431 ± 6.38)、(21.84 ± 2.11)個/HP，AKT miRNA組與對照組和空載體組比較，P均＜0.01，對照組與空載體組間比較無顯著差異。

3 討論

AKT是原癌基因c-akt表達編碼的一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是PI3K/AKT信號傳導通路的核心。PI3K/AKT信號通路可以調節 Bad和Caspase的活性，從而阻止腫瘤細胞啟動程序性死亡，抑制細胞凋亡［3］;有研究顯示，胃癌中 PI3K的突變可能導致AKT的活化，隨后引起AKT通路的過度激活，同時PI3K/AKT通路可激活和細胞周期依賴性蛋白激酶CDK，增加cyclins的表達，促進細胞增殖和分化［4］。本課題前期研究顯示，應用AKT抑制劑可增強胃癌細胞對化療藥物足葉乙甙敏感性［5］，而該通路的異常激活部分可抵消化療藥物的作用，從而促進胃癌細胞化療耐藥性的產生［6，7］。

人工miRNA元件以天然的miRNA為基礎骨架構建，在體外人工合成含有特定莖環結構的premiRNA片段，轉染入細胞后模擬內源性miRNA的形成及降解靶基因的過程，其有效沉默序列的篩選量要遠少于傳統的siRNA，且沉默效果高于siRNA，基于miRNA干擾的這些優點，miRNA成為繼siRNA之后RNA干擾領域又一重要的研究手段和實驗工具［9］。

本研究載體構建后轉染細胞，通過觀察目的細胞中熒光的表達，說明所構建的干擾質粒能夠有效地轉染目的細胞。轉染結果顯示，細胞中AKT mRNA和蛋白的表達顯著低于正常細胞和空轉染細胞，細胞的生長曲線顯示，AKT miRNA組細胞生長速度明顯低于空載體組和對照組，而未處理BGC823細胞與空載體細胞的生長速度無差異，說明miRNA干擾質粒對BGC823細胞的生長有抑制作用。Transwell實驗結果進一步顯示，AKT miRNA組細胞在侵襲能力上明顯低于對照組。以上結果均顯示AKT蛋白參與了胃癌BGC823細胞的增殖和侵襲過程。

綜上所述，AKT靶向miRNA干擾質粒可顯著抑制人胃癌BGC823細胞中AKT表達，并使BGC823細胞增殖和侵襲能力降低，因此可以推測AKT在人胃癌的發生、發展過程中發揮了重要作用。下一步我們將研究AKT在胃癌細胞耐藥，以及AKT的下游靶蛋白在胃癌細胞化療耐藥性中的作用，并探討應用基因干擾技術克服化療藥物耐藥的可行性，為尋求新的胃癌治療方案提供理論基礎。

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［5］徐細明，于紅剛，吳耀貴，等.蛋白激酶B抑制劑增強胃癌細胞對足葉乙甙敏感性的研究［J］.中華胃腸外科雜志，2007，10(2):138-142.

［6］Yu HG，Ai YW，Yu L，et al.Phosphoinositide 3-kinase/Akt pathway plays an important role in chemoresistance of gastric cancer cells against etoposide and doxorubicin induced cell death［J］.Int J Cancer，2008，122(2):433-443.

［7］艾耀偉，于紅剛，于皆平，等.PI3K/Akt/mdm2信號通路活化對胃癌細胞阿霉素敏感性的影響［J］.中華腫瘤雜志，2008，30(7):494-497.

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［9］Mestdagh P，Feys T，Bernard N，et al.High-throughput stem-loop RT-qPCR miRNA expression profiling usingminute amounts of input RNA［J］.Nucleic Acids Res，2008，36(21):143.