放療對耳蝸組織結構及脂質過氧化產物/抗氧化酶的影響

謝利紅，唐安洲，尹時華，譚頌華

(廣西醫科大學第一附屬醫院，南寧530021)

放射治療是鼻咽癌的主要治療手段，感音神經性耳聾為其常見并發癥［1］，但其發病機制尚不明確。有學者認為，放療后早期發生的感音神經性耳聾，可能為放療后脂質過氧化作用產生的一系列自由基反應導致毛細胞凋亡［2］。2010年，我們觀察了放療后豚鼠內耳形態學改變以及耳蝸脂質過氧化產物丙二醛(MDA)及抗氧化物酶超氧化物歧化酶(SOD)活力，為探討感音神經性耳聾的發生機制提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 白化豚鼠66只，體質量250～350 g，雌雄不拘。電耳鏡檢查無中耳感染，耳廓反應靈敏。隨機分為觀察組60只和對照組6只，觀察組右耳為照射耳。豚鼠喂養方法:自由飲水進食，室溫23～26℃。

1.2 方法

1.2.1 照射方法 觀察組用1%戊巴比妥鈉(3.5 μl/g)麻醉固定后，用GWXJ80型60Co遠距離治療機對右側耳顳部行一次性60Co照射70 Gy，輻射深度2.0cm，照射范圍為2cm ×2cm，源皮距 80cm，自制鉛板遮蓋非照射部位。對照組不予照射。

1.2.2 耳蝸組織結構觀察 觀察組分別于放療后1、4、7、14 和30 d 用1% 戊巴比妥鈉(3.5 μl/kg)麻醉后，斷頭經腹側取聽泡，暴露耳蝸并在蝸尖鉆孔，推鐙骨底板脫位，刺破圓窗膜，用4%多聚甲醛固定液灌流固定后，再放入固定液4℃固定24 h以上。用10%EDTA脫鈣10～14 d，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，耳蝸中軸切片。石蠟切片脫蠟和水化，蘇木精染液染色10min，1%鹽酸乙醇分色，流水沖洗10min藍化，0.5%伊紅染液染色1min，依次經70%、85%、95%、100%乙醇脫水，二甲苯透明，封片。光學顯微鏡下(×400倍)觀察照射耳蝸結構變化。

1.2.3 耳蝸組織MDA含量和SOD活性測定 取出－80℃冰箱保存的每只豚鼠的右側耳蝸，置于微型玻璃勻漿器中，先加入0.5 ml生理鹽水，于冰上研磨約15min后將勻漿液倒入1 ml的EP管中。再用0.4 ml生理鹽水沖洗玻璃勻漿器，洗液一并倒于EP管中。4℃離心，4 000 r/min離心15min。離心后取出上清液到另外一個EP管中，用于MDA水平和SOD活力測定。耳蝸組織MDA水平和SOD活力的測定按試劑盒說明書進行。

1.3 統計學方法 采用SPSS13.0統計軟件。采用單因素方差分析進行分析，組間比較采用LSD-t檢驗。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 耳蝸組織結構變化 光學顯微鏡下發現對照組耳蝸組織結構正常，未出現變性退化等異常改變，而觀察組螺旋神經節細胞(SGC)放療后各時點均出現了不同程度損傷，表現為耳蝸SGC萎縮(細胞質減少、細胞核濃縮凝集、缺失或者整個細胞缺失)，Corti器退化萎縮(內外毛細胞缺失逐漸加重，尤其是外毛細胞損害更明顯);放療后第4天血管紋可見輕微的充血水腫，第7、14天逐漸加重，第30天出現明顯的血管紋損傷(明顯的水腫或空泡形成)，隨放療時間延長，損傷更加明顯。

2.2 耳蝸組織MDA含量和SOD活性 見表1。

表1 兩組耳蝸組織MDA水平、SOD活性變化(n=8，±s)

表1 兩組耳蝸組織MDA水平、SOD活性變化(n=8，±s)

注:與對照組比較，*P ＜0.05，△P ＜0.01

組別 SOD(U/mg) MDA(nmol/mg)觀察組放療第1天 14.08± 2.90△ 0.49±0.10*放療第4天 11.83± 2.74△ 0.66±0.26△放療第7天 11.30± 2.98△ 0.88±0.30△放療第14天 8.70± 1.29△ 0.84±0.13△放療第20天 11.81± 1.60△ 1.08±0.32△對照組41.61 ±26.49 0.24 ±0.09

3 討論

放射治療是鼻咽癌等頭頸部惡性腫瘤的主要治療手段之一，感音神經性耳聾為其常見并發癥，尤其是近年來以鉑類為基礎的化療配合放射治療在鼻咽癌中的廣泛應用，感音神經性耳聾的發生率明顯升高［3］。研究發現，內耳所受的輻射劑量與感音神經性耳聾有顯著的相關性［4］，放療后內耳損傷呈劑量相關性［5］，放療后內耳基底膜細胞的損傷嚴重程度依次為外毛細胞＞內毛細胞＞柱狀細胞［6］。豚鼠耳顳部放療后數小時即可出現耳蝸細胞損傷［7］，表現為螺旋神經節細胞萎縮或消失，毛細胞缺失，血管紋的萎縮等表現。本研究發現，放療后第1天即可見螺旋神經節細胞質減少，放療后第14天Corti出現明顯的萎縮，放療后第30天可見明顯的水腫和空泡形成。

目前大多數學者認為，電離輻射致組織細胞損傷的可能機制是［8，9］:一方面輻射直接損傷 DNA 等生物大分子;另一方面，機體內富含大量的水，電離輻射作用于生物分子的周圍介質(主要是水)生成水射解的大量ROS、自由基，產生間接損傷DNA等生物大分子。其中以后者占主要作用。MDA和SOD是反映機體氧化和抗氧化的重要指標，研究發現，鼻咽癌患者在放療結束時，血漿SOD活力降低，MDA含量升高［10］。體外研究發現，小鼠耳蝸細胞系在放療后1 h即產生活性氧［2］，活性氧呈劑量相關性，20 Gy劑量放療后耳蝸細胞內ROS的產生比5 Gy的輻射量要明顯增多。認為活性氧是引起細胞凋亡的重要觸發因素。動物實驗證明，在其它非放療引起的耳蝸細胞損傷中，活性氧起到重要作用［11］，認為活性氧通過影響線粒體的滲透壓，促進細胞色素C的釋放，活化p53和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶，促進細胞凋亡［12］。本研究發現，放療后SOD活力明顯下降，MDA水平較放療前增加，并在形態學上表現為耳蝸細胞結構的損傷，這些結果間接反映了活性氧在電離輻射對耳蝸損傷中起到重要的作用。因而推測，放療導致耳蝸產生過多的活性氧，活性氧又引起脂質過氧化的發生，其產物MDA水平增加，對耳蝸起到保護作用的抗氧化物酶SOD活力降低，從而引起耳蝸細胞損傷。

綜上所述，放療導致的耳蝸細胞損傷及MDA升高、SOD下降在感音神經性耳聾的發生中起重要作用。

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