甲基強的松龍對脊髓損傷大鼠下丘腦視上核FOS、NOS表達的影響

李雪甫，傅玉峰，王永實，陳 培，丁 炯，肖 明

(1淮陰衛生高等職業技術學校，江蘇淮安223300;2南京醫科大學人體解剖教研室)

脊髓損傷(SCI)不僅引起損傷局部神經組織變性壞死、空洞形成和膠質瘢痕形成，還可累及傳導束，導致腦內運動中樞和內臟心血管活動核團內神經元萎縮、變性壞死，造成繼發性損傷與內臟、心血管功能紊亂［1］。2009年10月～2010年10月，我們觀察了甲基強的松龍(MP)對急性脊髓損傷(SCI)大鼠下丘腦視上核神經元FOS和一氧化氮合酶(NOS)表達的影響，旨在為SCI臨床治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料 SD大鼠12只(南京醫科大學動物中心提供)，雌雄不限，體質量200～300 g。將12只SD大鼠隨機分為治療組、損傷組、對照組各4只。主要試劑:硝基四氮唑藍(NBT，美國 Sigma公司);β-NADPH(美國Sigma公司);兔抗大鼠FOS(美國Sigma公司);含生物素標記的羊抗兔IgG(武漢博士德公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 模型制備及干預 治療組和損傷組采用橫斷法制作 SCI模型［2～4］，對照組為假手術組，治療組術后立即靜注MP 30 mg/kg，損傷組和對照組靜注相同劑量生理鹽水，三組均持續4周。

1.2.2 FOS、NOS表達檢測 三組分別于術后1 d、1周、4周常規左心室灌注，取含下丘腦視上核的組織，固定后置入含30%蔗糖的0.01 mol/L PBS，4℃過夜。Leica恒冷箱冰凍切片機連續切片，片厚30 μm，隔5張取2張，分2套收集于0.01 mol/L PBS內。一套行尼氏染色進行核團定位;另一套行NADPH-d組織化學及FOS免疫組織化學染色［5］。切片在反應液［0.1 mol/L PB(pH 8.0)，含 0.3%TritonX-100，0.6 g/L NBT，0.5 g/L β-NADPH］中 37℃避光孵育1 h，0.01 mol/L PBS充分洗滌，置入含兔抗大鼠 FOS(1∶3 000)0.01 mol/L，pH 7.4 PBS 中37℃孵育2 h;漂洗后，入含生物素標記的羊抗兔IgG液(1∶100)，37 ℃孵育30min;反復漂洗后，行ABC法顯色，0.01 mol/L PBS終止反應。貼片、風干、脫水、透明、封片。另選1只正常大鼠，灌注后取腦、切片，取含下丘腦視上核的切片，行免疫組化空白對照試驗。圖像分析和數據處理:根據 Paxino和Watson大鼠腦圖譜對尼氏染色切片上的下丘腦視上核進行定位，以確定該核團的主部。用Leica圖像分析系統對相應的FOS免疫組化和NADPH-d組織化學染色切片進行顯微攝像;每只大鼠統計4張切片，計數核團的主部FOS陽性細胞和NOS陽性神經元數目。FOS陽性細胞為細胞核著色，呈棕黃色;NOS陽性細胞為胞質著色，呈紫藍色。

1.3 統計學方法 采用SPSS10.0統計軟件。細胞計數與統計學分析均采取雙盲法。檢驗水準α=0.05。

2 結果

各組FOS、NOS陽性細胞數比較見圖1，由圖1可見損傷組1 d FOS、NOS陽性細胞數明顯高于對照組，治療組1、4周的FOS、NOS陽性細胞數明顯低于損傷組(P均＜0.05)。

圖1 各組FOS、NOS陽性細胞數比較

3 討論

研究發現，FOS在包括神經元在內的絕大多數正常細胞中均有低水平的表達，對細胞生長、分化和功能活動至關重要。FOS屬于即刻早期基因，中樞神經細胞受到特異性刺激后，神經細胞內FOS將快速表達，FOS蛋白大量合成并迅速堆積于胞核。通過表達和整合信息、作用于目的基因改變其轉錄水平而發揮細胞核內第二信使的作用。少量FOS參與神經細胞的生長分化和損傷修復的調節;而大量FOS表達對神經元有損傷作用。NOS是催化左旋精氨酸與分子氧生成的NO關鍵酶，同時也是生成的NO限速酶。其廣泛存在于神經系統，其同功酶有三種亞型，即在正常狀態下表達的神經元型NOS和內皮型NOS以及在損傷后誘導表達的誘導型NOS。來源于誘導型NOS和神經元型NOS的NOS有神經毒性作用，來源于內皮型NOS的一氧化氮有神經保護作用。正常情況下，下丘腦視上核內部有少量NOS陽性神經元，可催化左旋精氨酸生成 NO［6］。在傷害性刺激等狀態下，NOS mRNA表達增強，由NOS產生大量NO對神經細胞產生毒性作用［7］。

MP是目前經研究證實治療急性SCI、改善神經功能的有效藥物［8，9］。MP對神經系統作用的主要原理為減少脂質過氧化，促進局部血液循環，維持損傷早期的能量代謝。MP可抑制SCI后炎癥反應，抑制細胞因子的產生，包括 IL-6、IL-1α、IL-1β和腫瘤壞死因子，抑制細胞凋亡，從而增強神經的生存能力。本研究損傷組1 d FOS、NOS陽性細胞數明顯高于對照組，治療組1、4周的FOS、NOS陽性細胞數明顯低于損傷組，提示MP對SCI后下丘腦視上核神經元具有保護作用。

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［4］李雪甫，王永實，傅玉峰，等.甲基強的松龍對脊髓損傷后下丘腦室旁核FOS和NOS表達的影響［J］.南京醫科大學學報(自然科學版)，2011，31(2):40-43.

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