臍血漿在CIK細胞培養中的應用

席作明，趙 青，周長輝，陳雙峰*

(1聊城市東昌府區婦幼保健院，山東聊城252000;2聊城市人民醫院)

細胞因子誘導的殺傷細胞(CIK細胞)是一類非MHC限制性的免疫活性細胞，具有擴增能力強、殺瘤活性高和抗瘤譜廣的特點［1］，是目前腫瘤過繼性免疫治療的主要細胞［2］。以往CIK細胞主要由患者外周血的單個核細胞誘導培養而成，因受治療周期及患者身體素質的影響，其應用受到一定限制。研究發現，臍血來源的CIK細胞初始提取效率高，擴增速度快，殺傷活性及主要效應細胞陽性比例高［3，4］，為 CIK 細胞的臨床應用提供了更為廣泛的細胞來源。但CIK細胞培養過程中需要大量的人AB血漿，給臨床應用帶來了一定的困難。2009～2010年，我們應用臍血漿進行臍血CIK細胞誘導培養，并與人AB血漿培養的臍血CIK細胞進行了比較，探討其替代人AB血漿的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料 白血病K562細胞株由本實驗室凍存;無菌采集的臍帶血100 ml為我院婦產科提供，來自健康正常分娩產婦。主要試劑及儀器:重組人IFN-γ，重組人IL-2、抗CD3單克隆抗體購自英國Pepro-Tech公司;Ficoll Paque PREMIUM 1.077 、磷酸緩沖液PBS購自美國GE公司;CD3-FITC/CD56-PE、同亞型對照抗體兔抗鼠IgG、BDFACS Aria流式細胞儀購自美國BD公司;RPMI1640培養基購自美國Hyclone公司;AB血清購自杭州四季青公司;CCK-8試劑盒購自上海碧云天公司;IL-2、IL-12、GM-CSF ELISA試劑盒購自美國Invitrogen公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 臍血漿細胞因子檢測 采用ELISA法檢測正常人外周血漿及臍血漿中IL-2、IL-12、粒細胞—巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)的含量，具體步驟按照ELISA試劑盒操作說明進行。

1.2.2 臍血漿及臍血單個核細胞制備 將臍帶血置于50 ml無菌離心管中，2 000 r/min離心10min，取上層血漿，56℃，滅活30min，分裝后置于－80℃凍存備用。用等體積PBS稀釋沉淀，輕輕混勻，按1∶1(體積比)比例緩慢疊加于含有Ficoll分離液的50 ml離心管中，1 800 r/min離心30min。吸取中間層單個核細胞層并用適量PBS懸浮細胞，2 000 rpm水平離心5min，PBS洗滌細胞2次。

1.2.3 CIK細胞誘導培養 臍血單個核細胞于37℃、5%CO2孵箱中培養4 h，棄去貼壁細胞，調整細胞濃度為2×106/ml。分為兩組，AB血漿組加入含10%AB血漿的RPMI1640培養基;臍血漿組加入含10%臍血漿的RPMI1640培養基。兩組均加入IFN-γ 1 000 U/ml(第0天)，24 h后，加人CD3單克隆抗體 50 ng/ml、IL-2 500 U/ml，繼續培養，以后每 3 d全量換液1次，并補充IL-2 500 U/ml。培養21 d后收獲細胞。

1.2.4 CIK細胞計數及免疫表型測定 取部分細胞置EP管內經PBS洗滌，調整細胞濃度為1×106/ml，分別加入 6 μl抗人 CD3-FITC，CD56-PE，對照管分別加入同量的抗人IgG1-FITC，IgG1-PE單克隆抗體，混勻后室溫下避光孵育20min，采用流式細胞儀分別于第0、5、7、14、21 天計數 CIK 細胞，比較其擴增情況。于第0、21天測定CIK細胞表面抗原及

1.2.5 CIK細胞毒性檢測 將培養21 d的CIK濃度調整為2×106/ml，K562細胞濃度調整為1×105/ml，按效應細胞:靶細胞 =1∶1，10∶1，20∶1 的比例放入96孔板，另設單獨效應細胞和單獨靶細胞孔，每組設5個平行孔，置37℃、5%CO2孵箱中培養4 h，然后每孔中加入10 μl CCK-8溶液并放置培養箱中孵育2 h，450 nm波長檢測吸光度(A)值，并計算細胞殺傷活性。細胞毒活性計算公式:殺傷活性(%)=［靶細胞 A值 －(效應細胞 A值 －實驗組 A值)］/靶細胞A值×100%

1.3 統計學方法 采用 SPSS11.0統計軟件，計量數據以±s表示。數據比較采用t檢驗。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CIK細胞的擴增情況 兩組CIK細胞均可大量增殖，前5 d增殖較為緩慢。在第7天細胞開始快速增殖，培養21 d后臍血漿組及AB血漿組CIK細胞數量無顯著差異;CIK細胞增殖倍數分別為(81.3 ±9)、(75.7 ±8)倍，P ＞0.05。免疫表型檢測結果見表1，兩組細胞陽性率無明顯差異(P＞0.05)。

表1 兩組單個核細胞培養前后表面抗原變化(n=5，%，±s)

表1 兩組單個核細胞培養前后表面抗原變化(n=5，%，±s)

細胞0天 第21天CD+3CD+56 7 ±0.60 29.3 ±2.6 AB血漿組55.7 ±9 96.4 ±5 1.57 ±0.60 28.7 ±3.1

2.2 CIK細胞殺傷活性 見表2。

表2 不同效靶比臍血CIK細胞對K562細胞的殺傷作用(n=5，%，±s)

表2 不同效靶比臍血CIK細胞對K562細胞的殺傷作用(n=5，%，±s)

注:與同組10∶1比較，*P ＜0.01;與同組20∶1 比較，△P＜0.01

1∶1 10∶1 20∶1臍血漿組 14.1 ±4.2 42.8 ±9.1* 56.7 ±12.5組別 效應細胞∶靶細胞＊△AB 血漿組 13.6 ±4.0 43.7 ±9.8* 55.8 ±12.0＊△

2.3 臍血漿IL-2、IL-12、GM-CSF含量 見表3。

表3 臍血漿及人正常外周血漿中IL-2、IL-12、GM-CSF 含量(n=5，±s)

表3 臍血漿及人正常外周血漿中IL-2、IL-12、GM-CSF 含量(n=5，±s)

注:與 AB 血漿組比較，*P ＜0.05，△P ＜0.01

IL-2 IL-12 GM-CSF臍血漿組 389.6 ±45.7* 1 172.1 ±229.5△ 121.3 ±23.5組別△AB血漿組311.6 ±46.5 332.5 ± 78.9 13.6 ± 3.2

3 討論

血漿是CIK細胞誘導培養過程中的重要添加成分，可為細胞生長提供必需的營養因子。應用人AB血漿培養CIK細胞可能占用臨床血漿治療資源，同時，同種異體血漿中抗體的異質性可能會影響到CIK細胞的表型變化，給臨床應用帶來了一定困難。臍血來源廣泛，采集方便，免疫原性低，不會給捐獻者帶來痛苦和感染，如能替代AB血漿進行CIK細胞培養，不僅節省資源，還可望能提高CIK細胞增殖能力和殺傷活性，增強過繼免疫治療效果。細胞因子是影響CIK細胞質量的關鍵因素，各種來源CIK細胞在其培養過程中均需添加多種細胞因子，如 IFN-γ、IL-1、IL-2、IL-12、GM-CSF 等［5～8］。IL-2可提高抗腫瘤活性、促進T、B淋巴細胞的增殖分化，還能與CD3mAb、IFN-γ產生協同促進CIK細胞增殖，提高CIK細胞增殖率。IL-12是免疫調節網絡中的關鍵調節分子，可刺激多種免疫細胞的增殖和殺傷作用，對CIK細胞的增殖同樣具有促進作用，可以和IL-2協同促進CIK細胞增殖，提高CIK細胞數量。IL-12具有多重抗腫瘤生物活性，不僅對腫瘤有直接的抑制作用，而且可以調節機體免疫系統，使其處于有效發揮抗腫瘤作用的細胞免疫應答狀態，在CIK細胞培養過程中添加適量IL-12可以顯著增強其殺傷活性［7，8］。GM-CSF主要由活化的T細胞、巨噬細胞等細胞產生，可促進粒細胞、單核細胞的增殖與分化，增強殺菌及抗腫瘤作用［9］，添加GM-CSF可使CIK細胞擴增倍數進一步提高。本研究發現，臍血漿中IL-2、IL-12、GM-CSF的含量均高于正常人外周血漿，可有效增強臍血CIK細胞的增殖能力及殺傷活性。本研究顯示臍血漿誘導培養的CIK細胞無論是增殖能力，CD+3CD+56效應細胞陽性率還是對K562細胞的殺傷活力與人AB血漿相比均無顯著性差異，證明臍血漿可代替AB血漿進行臍血CIK細胞的培養。

總之，臍血漿可代替人AB血漿培養出具有高效增殖能力及高殺傷活性的臍血CIK細胞，臍血漿的應用可為CIK細胞的培養提供新的、高效的血漿來源，為推廣CIK細胞的臨床應用提供保證。

［1］Yamaguehi Y，Ohshita A，Kawabuchi Y，et al.Adoptive immunotherapy of cancer using activated autologous lymphocytes-current status and new strategies［J］.Hum Cell，2003，16(4):183.

［2］匡志鵬，謝裕安，梁安民，等.細胞因子誘導的殺傷細胞的生物學特性及抗腫瘤作用研究［J］.廣西醫學，2006，28(8):6149-6151.

［3］Introna M，Franceschetti M，Ciocca A，et al.Rapid and massive expansion of cord blood-derived cytokine-induced killer cells:an innovative proposal for the treatment of leukemia relapse after cord blood transplantation［J］.Bone Marrow Transplantation，2006，38(9):621-627.

［4］牟青杰，王杰，崔為發，等.三種來源CIK細胞體外增殖及殺傷活性比較［J］.山東醫藥，2010，11(50):7-9.

［5］李淑艷，邢淑賢.CIK細胞的特點及其在腫瘤生物治療中的作用［J］.癌變·畸變·突變，2007，5(19):424-426.

［6］邢宏，韓方正，汪莉萍.細胞因子誘導的殺傷細胞(CIK)的基礎與臨床研究新進展［J］.中國免疫學雜志，2011，1(27):88-92.

［7］秦莉，王志華，殷秀敏，等.IL-12對CIK細胞體外增殖及體內外殺瘤活性影響的實驗研究［J］.實用腫瘤學雜志，2007，3(21):212-15.

［8］Liu WW，Chen JY，Yu W，et al.Clinical experiment of cytokines induced killer cells for treatment of benzene poisoning［J］.Zhong hua Lao Dong Wei Sheng Zhi Ye Bing Za Zhi，2007，25(9):546-549.

［9］孫耘玉，陳寶安.CIK細胞在惡性血液系統疾病中的應用研究［J］.現代醫學，2004，32(5):347-348.