結腸癌組織中RASSF1A基因啟動子甲基化狀態、mRNA表達變化及意義

李純堅，晏 立，文習剛，羅金波

(湖北省中山醫院，武漢430033)

RAS相關區域家族1A(RASSF1A)基因是從3號染色體短臂克隆出來的抑癌基因，編碼產物具有DNA修復蛋白XPA功能及調控細胞凋亡作用，其表達異常與多種癌癥的發病有關［1］。本研究觀察了結腸癌組織中RASSF1A基因啟動子甲基化狀態、mRNA表達變化。現將結果報告如下。

1 資料與方法

1．1 臨床資料 2006年1月～2009年12月本院收治的結腸癌患者80例，男48例，女32例;年齡35～75歲。均經結腸鏡和手術病理組織學檢查確診。Dukes分期A期16例、B期24例、C期27例、D期13例。病理組織學分型腺癌40例、黏液細胞癌25例、未分化癌15例。留取結腸癌組織及癌旁正常結腸組織。

1．2 RASSF1A啟動子甲基化檢測 采用甲基化特異性PCR(MSPCR)技術。提取結腸癌組織和癌旁正常結腸組織中的RASSF1A基因啟動子區域。提取基因組DNA后按EZ DNA Methylation Kit試劑盒操作，將DNA模板未甲基化胞嘧啶轉化為尿嘧啶，轉化后的樣本進行PCR擴增，擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳顯影后檢測。

1．3 RASSF1A基因mRNA檢測 采用RT-PCR技術。根據RNA提取試劑盒操作說明書提取結腸癌組織和癌旁正常結腸組織中RASSF1A基因的RNA，以GAPDH作為內參照，進行PCR擴增。擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳顯影后檢測。

1．4 統計學方法 采用SPSS12．0統計軟件。計數資料比較用χ2檢驗。P≤0．05為差異有統計學意義。

2 結果

80例結腸癌癌旁正常結腸組織中的RASSF1A基因啟動子未見甲基化，80例結腸癌組織中有58例(72．5%)RASSF1A基因啟動子處于甲基化狀態，兩者相比，P ＜0．01。

80例結腸癌癌旁正常結腸組織均檢測到RASSF1A基因 mRNA，58例結腸癌組織中RASSF1A基因啟動子甲基化者未檢測到RASSF1A基因mRNA、22例未甲基化者可檢測到RASSF1A基因 mRNA。RASSF1A基因 mRNA隨著結腸癌Dukes分期增加而降低，Dukes D期RASSF1A基因mRNA呈完全缺失狀態。

RASSF1A基因啟動子甲基化與結腸癌病理分型、淋巴結轉移、遠處轉移和Dukes分期有關(P均＜0．05)，見表1。

3 討論

DNA甲基化是最早發現的基因轉錄前修飾途徑之一。在真核細胞DNA中約80%CpG存在甲基化，主要發生在基因啟動子的核心序列和轉錄起始點，可延伸至第1外顯子區域，這些區域被定義為CpG島。DNA甲基化可引起基因組中相應區域染色質結構、DNA構象、DNA穩定性及DNA與蛋白質相互作用方式的改變。甲基化結構自身或結合DNA甲基結合蛋白(MBP)阻止轉錄相關因子結合DNA，從而調控 mRNA轉錄和翻譯［2］，與腫瘤的發生發展關系密切［3］。

表1 RASSF1A基因啟動子甲基化與結腸癌臨床病理參數的關系(例)

秦豫培等［4］研究發現，食管癌組織中RASSF1A基因甲基化率為40%，癌旁正常食管組織為13%;Hu等［5］發現，肝癌組織RASSF1A基因啟動子甲基化率顯著高于正常肝組織，腫瘤越大、TNM分期越晚，RASSF1A基因啟動子甲基化率越高。本研究發現，結腸癌癌旁正常結腸組織中的RASSF1A基因啟動子未見甲基化，而在結腸癌組織中RASSF1A基因啟動子甲基化發生率高達72．5%;結腸癌分化程度越低、有淋巴結轉移和遠處轉移及Dukes分期越晚，其RASSF1A基因啟動子甲基化發生率越高。結腸癌組織中RASSF1A基因啟動子甲基化者其mRNA表達缺失。說明RASSF1A基因啟動子甲基化可能與結腸癌的發生發展及轉移有關。

［1］Yi M，Yang J，Chen X，et al．RASSF1A suppresses melanoma development by modulating apoptosis and cell-cycle progression［J］．J Cellular Physio，2011，226(9):2360-2369．

［2］Tian Y，Hou Y，Zhou X，et al．Tumor suppressor RASSF1A promoter:p53 binding and methylation［J］．PLoS One，2011，6(2):17017．

［3］ Mao WM，Li P，Zheng QQ，et al．Hypermethylation-modulated downregulation of RASSF1A expression is associated with the progression of esophageal cancer［J］．Arch Medi Res，2011，42(3):182-188．

［4］秦豫培，王立東，常志偉，等．食管癌組織與外周血RASSF1A甲基化的檢測及其臨床意義［J］．中華腫瘤防治雜志，2009，16(5):359-361．

［5］Hu L，Chen G，Yu H，et al．Clinicopathological significance of RASSF1A reduced expression and hypermethylation in hepatocellular carcinoma［J］．Hepat Inter，2010，4(1):423-432．