康腦液2號對腦缺血再灌注損傷大鼠血清及腦組織中NO、NOS含量的影響*

石會娟 梁起保 薛 茜 鄒玉安△

1河北北方學院（河北張家口075000）

2河北省新樂市醫院（河北新樂050700）

3河北北方學院附屬第一醫院（河北張家口075000）

缺血性腦中風主要以藥物治療為主，中藥復方以其多水平、多通道、多靶點治療原則備受青睞。康腦液2號主要由黃芪、當歸、川芎、葛根、鉤藤、地龍、天麻、三七等中藥組成，以益氣活血化瘀、清熱平肝、息風定驚為主要功能。本實驗通過建立大鼠腦缺血再灌注模型，觀察康腦液2號對大鼠血清及腦組織中一氧化氮（NO）、一氧化氮合酶（NOS）含量的影響，并探討其可能的作用機制，為缺血性腦血管病的臨床治療提供依據。

1 材料和方法

1.1 動物成年健康雄性SD大鼠40只，SPF級，體質量（280±10）g，由北京大學醫學部實驗動物中心提供，許可證號：SCXK（京）2001-2008。

1.2 藥物康腦液2號主要由黃芪、丹參、川芎、葛根、鉤藤、地龍、天麻、三七等組方。制備：冷水浸泡20min后，常規煎煮3次，再將3次所煎的藥汁上清液混合，文火煎濃縮至70mL。依達拉奉注射液（南京先聲東元制藥有限公司提供，國藥準字H20050280）。

1.3 試劑和儀器NO、NOS試劑盒 （南京建成生物工程研究所，批號：20100625）；其他試劑均為國產分析純。栓線（北京沙東生物技術有限公司產品）；光學顯微鏡（日本Olympus BX60型）LabTech-紫外分光光度計（北京萊博泰科儀器有限公司）等。

1.4 分組及造模隨機分為假手術組、模型組、康腦液2號組（14.30g/kg·d），依達拉奉組（10.00mg/kg·d），每組 10 只。 術前 7d灌胃給藥，每日1次，每次給藥2mL（相當于原生藥4g），假手術組、模型組灌胃等容量生理鹽水。末次灌胃后1h參照改進Longa［1］線栓法制備大鼠MCAO模型。模型組及治療組插入栓線約18～20cm，缺血2h后將栓線拉回頸總動脈進行再灌注24h。假手術組不插入線栓，其余步驟同上。

1.5 神經系統癥狀評分標準0分，未觀察到神經功能缺陷癥狀；1分，不能完全伸展手術對側前爪；2分，向手術對側轉圈；3分，向手術對側傾倒；4分，不能自發行走，意識昏迷。

1.6 標本采集與檢測腦梗死體積測定：斷頭后立即冰浴取腦，分離并去除嗅球、小腦和低位腦干，置于-20℃冰箱冷凍20min，取出連續冠狀切片，置于2%氯化2，3，5-三苯基四氮唑（TTC）磷酸鹽緩沖液中，37℃避光恒溫孵育 30min，7～8min翻動1次，正常腦組織染成紅色，梗死區為蒼白色，置于4%多聚甲醛溶液固定24h，拍照，分離紅色和白色區域，稱質量并計算梗死體積。HE染色觀察組織學變化：10%水合氯醛麻醉大鼠，開胸左心室插管，灌注肝素鹽水50mL（100U/mL），迅速剪開右心耳繼續灌注4%多聚甲醛300mL，30min開顱取腦，去除小腦和腦干，從視交叉平面行4mm厚冠狀切片，將腦片放入4%多聚甲醛固定液中固定，腦片經常規梯度脫水、透明、包埋、切片，蘇木精伊紅染色，光鏡下觀察組織學變化。血清及腦組織NO、NOS含量測定：缺血2h再灌注24h后斷頭取血，分離血清，冰浴取腦，右側腦組織用4℃生理鹽水制成10%腦組織勻漿，3500r/min離心15min，取上清置于-80℃冰箱備用。按照試劑盒說明書測定血清以及腦組織中NO含量及NOS活力。

1.7 統計學處理采用SPSS 10.0統計軟件。組間比較采用單因素方差分析，各項指標以（±s）表示。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組神經功能評分比較與假手術組比較，模型組大鼠出現明顯的神經功能缺損癥狀 （P<0.05），腦缺血2h再灌注24h后神經功能缺損癥狀最明顯；與模型組比較，康腦液2號組及依達拉奉組神經功能缺損癥狀明顯減輕，差異具有統計學意義（P<0.05）。 結果見表 1。

表1 各組神經功能評分及腦梗死體積比較 （±s）

表1 各組神經功能評分及腦梗死體積比較 （±s）

與假手術組比較,*P＜0.05;與模型組比較,△P＜0.05;與依達拉奉組比較,▲P＜0.05。下同。

腦梗死體積（mm3）假手術組 10 0組 別 n 神經功能評分（分）模型組 10 2.49±0.16* 235.63±20.16*康腦液 2號組 10 1.21±0.12*△▲ 128.68±28.18*△▲依達拉奉組 10 1.62±0.14*△ 127.32±10.14*△

2.2 各組腦梗死體積比較與假手術組比較，模型組可見明顯腦梗死灶，差異具有統計學意義（P<0.05）；與模型組比較，康腦液2號組及依達拉奉組腦梗死體積顯著降低（P<0.05）。結果見表1。

2.3 各組腦組織形態學變化光鏡下觀察，假手術組大腦皮質及海馬神經細胞形態基本正常，核仁清晰，核膜完整。模型組缺血側大腦皮層和海馬神經細胞變性壞死明顯，胞體腫脹，周圍間隙增寬，結構不清，出現不同程度的變形、核深染、核固縮、核溶解、細胞壞死、間質疏松等現象，神經元細胞腫脹和間質水腫較為明顯。與模型組比較，康腦液康腦液2號組及依達拉奉組可明顯改善上述病理變化。

2.4 各組血清及腦組織NO含量及NOS活力比較與假手術組比較，模型組血清及腦組織中NO含量及NOS活性顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，康腦液康腦液2號組及依達拉奉組NO含量及NOS活性顯著降低（P<0.05）。見表2、表3。

表2 各組大鼠腦組織NOS活力、NO含量比較 （±s）

表2 各組大鼠腦組織NOS活力、NO含量比較 （±s）

NO（μmol/mg）假手術組 6 2.83±0.46 85.86±13.46組 別 n NOS（U/mg）模型組 6 7.94±1.02* 192.65±10.52*康腦液2號組 6 3.49±0.38*△▲ 117.26±16.57*△▲依達拉奉組 6 3.97±0.66*△ 127.26±12.85*△

表3 各組大鼠血清NOS活力、NO含量比較 （±s）

表3 各組大鼠血清NOS活力、NO含量比較 （±s）

組 別 n假手術組 6 NOS（U/mL）18.69±3.93模型組 6康腦液2號組 6 29.63±3.64*23.25±4.75*△▲依達拉奉組 625.27±4.86*△NO（μmol/mL）39.75±8.02 79.97±4.56*43.73±7.53*△▲49.73±10.38*△

3 討 論

NO是一種新的自由基、神經遞質，對缺血性腦血管疾病的發生和發展有著十分重要的作用。正常狀態下生物體內NO具有內皮源舒張因子的特性，可舒張腦血管、調節腦血流，并可作為神經介質參與長程增強效應、突觸的可塑性和記憶的形成等［2］。腦缺血再灌注損傷后，NO在中樞神經系統所發揮的作用主要取決于NO在生物體內的濃度、產生部位和時間、作用部位的不同及其氧化還原狀態等復雜的生物學性質。氧化狀態的NO，能調節離子通道，減少胞質游離Ca2+水平而發揮腦保護作用，而還原型的NO可迅速與超氧陰離子反應生成毒性更強的過氧亞硝酸陰離子（ONOO-），導致膜功能失調；過量的NO又可通過多種信號轉導途徑引起神經損害，加重腦缺血損傷。NOS是合成NO的限速酶。腦缺血發生后血管內皮細胞內皮型一氧化氮合酶（eNOS）免疫陽性表達立即增加，源于eNOS的NO對腦缺血具有神經保護作用，能通過激活鳥苷酸環化酶使血管平滑肌舒張，抑制血小板聚集和白細胞黏附，增加半暗帶區腦血流量，抑制內皮素的生成［3-4］。隨著缺血時間的延長，腦缺血后期，Ca2+超載可上調源于nNOS和iNOS的NO在神經組織中的表達［5-6］，對缺血后的腦組織具有神經毒性作用，可介導興奮性氨基酸（EAA）的毒性，促進自由基生成，損傷線粒體，誘導細胞凋亡。

缺血性腦血管病屬中醫學“中風”范疇，本病因患者素體氣血虧虛，與心、肝、腎陰陽失調，加以憂思惱怒，或勞累、外邪等誘因下，致氣血運行受阻，肌膚筋脈失于濡養，致陰虧于下，肝陽暴漲，陽化風動，血隨氣逆，夾痰夾火，橫竄經絡，蒙蔽清竅而猝然昏仆，半身不遂等癥。康腦液2號是專門為氣虛血瘀患者而設的臨床經驗方，從益氣活血的鼻祖方補陽還五湯按照現代人特點化裁而來，由黃芪、當歸、川芎、葛根、地龍、三七、丹參、天麻、鉤藤等組成，君以大量黃芪補氣升陽，益衛固表。當歸善于活血養血，有化瘀而不傷血之妙，是為臣藥。川芎、葛根、地龍、三七、丹參等助當歸活血化瘀，為佐藥。鉤藤、天麻引藥上行，是為使藥，君臣佐使共奏補氣活血化瘀之功。并且近年來各味中藥的單藥研究［7-10］表明，均有不同程度的抗自由基、擴張血管、改善微循環、抗血小板聚集、抑制微小血栓形成、減少細胞內鈣蓄積等作用。

在臨床上，益氣活血法是治療缺血性腦卒中的常用方法，本研究采用康腦液2號組方對腦缺血再灌注損傷大鼠進行干預，模型組血清及腦組織勻漿中NO含量及NOS活性明顯高于假手術組，而藥物治療組血清及腦組織勻漿中NO含量及NOS活性有所降低，說明腦缺血再灌注損傷時NO可加重腦組織損傷程度，而康腦液能降低腦組織中NO的含量及NOS活性以減輕神經細胞損傷。NO在缺血性腦損傷的病理過程中發揮了重要作用，并且與NOS表達的變化密切相關，康腦液2號可能通過調節腦缺血再灌注損傷后血清及腦組織中NO、NOS表達而減輕神經細胞損傷，使腦血管病的防治更進步，為缺血性腦血管病的預防及治療提供了新的前景。

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