電針水溝對腦出血大鼠大腦皮質NPY調節作用的動態觀察*

杜艷軍 孫國杰 孔立紅

湖北中醫藥大學針灸骨傷學院（湖北武漢430061）

近年來，越來越多的臨床資料表明血腫擴大及其繼發性腦損害是導致腦出血病情加重甚至死亡的主要原因，腦血管的舒縮功能則直接影響腦出血后血液的循環與調節。目前關于神經肽Y（NPY）在腦血管內皮細胞的作用研究較少。本實驗將采用免疫組化方法，觀察NPY在大腦皮層神經細胞和內皮細胞中的表達，初步探討電針水溝對腦出血大鼠腦血管神經調節的動態影響。

1 材料與方法

1.1 材料健康青年wistar大鼠80只，體質量200～250g，雌雄各半，湖北省醫學科學研究院實驗動物中心提供。SABC試劑盒和兔抗大鼠NPY單克隆抗體購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 腦出血模型復制將wistar大鼠隨機分為8組：正常組、假手術組、模型 3、24、72h 組、電針 3、24、72h 組，每組各 10 只。 采用膠原酶Ⅶ誘發的大鼠尾殼核出血模型［1］。動物經6%水合氯醛腹腔麻醉（400mg/kg），頭頂備皮后將動物固定于腦立體定位儀（WDT-Ⅱ微電極推進器腦立體定位儀，國營西北光學儀器廠）上，正中矢狀切開頭皮，剝離骨膜，調節門齒托的高度，使動物的前、后囟處于同一水平。以前囟為坐標原點，向后1.0mm，向右4.0mm，確定注射點坐標，用手動微型鉆（直徑1.0mm）在注射點鉆透顱骨。用1μL的微量注射器吸取0.8μL的膠原酶Ⅶ溶液（Sigma 0.5U/μL），緩慢進針 5.0mm，緩慢注射后留針 2min，緩慢退針，鉆孔處填入明膠海綿止血。縫合皮膚，腹腔注射氨芐青霉素8萬U，動物清醒后放回籠內飼養。

1.3 針刺方法按照常用動物穴位定位法取大鼠水溝穴，用26號、1寸不銹鋼毫針針刺，接G6805－II電針治療儀（空白電極接大鼠耳朵），連續波，頻率120次/min，強度1mA，留針30min。在造模大鼠麻醉清醒后立即針刺1次，每隔24h再針刺1次。

1.4 Bederson神經體征評分法0級：無任何行為異常，無缺損體征。1級：左前肢屈曲。2級：無旋轉運動，但對來自右側推力的抵抗力減弱。3級：對來自右側推力的抵抗力減弱的同時，出現向左側的旋轉運動。

1.5 免疫組織化學染色將各組大鼠腹腔注射6%水合氯醛麻醉，開胸經升主動脈依次灌入生理鹽水100mL、4℃預冷的含4%多聚甲醛的0.01mol/L磷酸緩沖液（pH7.4）400mL。灌畢取腦，取視交叉至乳頭體之間上至皮層長約5mm的腦組織，置于4%多聚甲醛溶液過夜后固定，石蠟包埋切片，片厚5μm。按免疫組化SABC法常規步驟操作。每只動物隨機選取2張非連續切片，每張切片在出血側大腦皮層隨機采集3個視野。光鏡下檢測。以胞質染成棕色為陽性結果，用HPIAS-1000高清晰度圖像分析儀（華中科技大學同濟醫學院千屏影像公司產）對各組陽性細胞進行吸光度分析。

1.6 統計學處理所有數據以（±s）表示，應用SPSS 11.0統計軟件分析，組間樣本均數差異比較選單因素方差分析，組間比較用q檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 電針對尾殼核出血大鼠神經缺損行為體征的治療作用

見表1。造模大鼠麻醉醒后模型組與電針組的神經缺損體征綜合評分無明顯差異（P＞0.05），且電針組的神經缺損體征略高于模型組。電針組大鼠神經缺損體征綜合評分逐時遞減，3、24、72h時均與模型組比較有顯著差異（P<0.05或0.01）。

表1 模型組與電針組不同時間點神經缺損體征評分比較 （分，±s）

表1 模型組與電針組不同時間點神經缺損體征評分比較 （分，±s）

與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。 下同。

組 別 n 造模醒后 3h 24h 72h模型組 30 2.90±0.03 2.90±0.03* 2.77±0.04** 2.70±0.06**電針組 30 2.93±0.02 2.57±0.07* 1.67±0.09** 1.03±0.03**

2.2 各組大鼠大腦皮質NPY免疫陽性細胞的表達見表2、表3、圖1。正常組與假手術組大鼠大腦皮質神經元和內皮細胞有少量的NPY陽性表達；腦出血后3h大鼠大腦皮質NPY的陽性表達開始增高，24h呈最高峰，胞漿和突起濃染呈棕褐色，血管內皮細胞細胞質中有棕色顆粒，72h時有所下降，與正常組比較均差異有統計學意義（P<0.01）。電針組大鼠大腦皮質神經元和內皮細胞的NPY陽性表達，也于3h開始表達，于24h表達較高，72h表達減弱，與模型組及正常組比較均有顯著差異（P<0.05或 0.01）。

表2 各組大鼠不同時間點大腦皮質NPY陽性反應平均光密度值比較（±s）

表2 各組大鼠不同時間點大腦皮質NPY陽性反應平均光密度值比較（±s）

與正常組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。 下同。

組 別 n 3h 24h 72h正常組 10 0.1135±0.0413假手術組 10 0.1066±0.0314模型組 10 0.2603±0.0367△△ 0.3901±0.0634△△ 0.2094±0.0442△△電針組 10 0.1708±0.0412**△△ 0.1680±0.0421**△△ 0.1649±0.0535**△△

表3 各組大鼠不同時間點大腦皮質血管內皮細胞NPY陽性細胞率比較 （%，±s）

表3 各組大鼠不同時間點大腦皮質血管內皮細胞NPY陽性細胞率比較 （%，±s）

組別 n 3h 24h 72h正常組 10 11.24±1.18假手術組 10 12.86±1.06模型組 10 21.19±3.11△△ 33.65±4.27△△ 19.41±2.38△△電針組 10 14.97±2.23**△ 15.44±2.23**△ 14.69±2.42**△

3 討 論

腦出血是發病率、死亡率及致殘率都很高的急性腦血管疾病。近幾年隨著CT、正電子發射斷層掃描（PET）和彌散加權成像（DWI）的運用，血腫擴大和缺血半暗帶再次成為腦出血病理研究的熱點［2］，認為腦出血后血腫擴大和局部腦血流（rCBF）下降造成缺血、缺氧是早期神經功能惡化的重要原因之一。Warach［3］更結合患者的神經功能惡化和轉歸進行細致的研究分析后，認為rCBF下降者發生神經功能惡化和預后不良的概率遠高于rCBF無變化者。因而腦血管調節機制在腦出血后腦循環發生一系列改變中具有重要作用。

NPY是腦內含量最高的發揮神經遞質和血管調節活性作用的多肽［4-5］，具有強烈收縮腦血管和降低腦血流的效應。主要分布在大腦皮質、丘腦和腦干。向大鼠頸內動脈注射NPY可使腦血流下降40%～98%［6］；臨床發現腦出血患者血漿NPY濃度顯著升高，且隨病情好轉而降低［7］。目前認為NPY的增高勢必引起血管收縮，進一步升高血壓，持續出血及擴大血腫，并加重周圍組織缺血缺氧［8］。

圖1 各組大腦皮層的NPY陽性神經元表達（×200）

前期我們觀察了針刺水溝對急性不完全腦缺血大鼠腦底動脈NPY的密度影響，結果發現腦血管的NPY能神經參與了針刺水溝增加腦血流的效應。本實驗顯示正常組與假手術組大鼠大腦皮質神經元有少量的NPY陽性表達；腦出血后3h大鼠大腦皮質NPY的陽性表達開始增高，24h達最高峰，胞漿和突起濃染呈棕褐色，血管內皮細胞細胞質中有棕色顆粒，72h時有所下降，但依然可見細胞軸突與纖維呈棕褐色，與正常組比較均有顯著差異。電針水溝則能有效抑制大腦皮質神經元NPY的增強，此與電針能降低凝血酶的活性、抑制炎性反應及改善血液流變性等機制有關。

本實驗同時發現腦出血的大鼠內皮細胞也有NPY的陽性表達，且伴隨時間而發生變化。目前關于腦血管內皮細胞介導NPY作用的研究較少。Bao L等［9］研究發現內皮細胞上存在較多的NPY1受體。認為NPY可通過對內皮細胞的作用，產生血管活性物質［10］，增強或減弱其他遞質對血管的刺激作用，從而影響血管的生成［11］及腦血流。更有學者認為NPY通過減少細胞內cAMP的含量，以調整內皮細胞對大分子滲透性，而具有內皮屏障功能［12］。實驗通過電針水溝可降低腦出血后3h血管內皮細胞胞質的NPY表達，但并未隨著時間呈現明顯的降低趨勢，3、24、72h時間段內皮細胞NPY的表達無顯著差異，其具體機制尚不清楚。

綜上表明，腦出血后NPY對腦血管的調節作用是多方面的。NPY的收縮血管功能與NPY對血管內皮細胞的作用效應之間是何關系，腦出血后不同時間段NPY對血管內皮細胞的作用效應是否存在不同，是今后值得進一步研究的問題。

［1］Rosenberg GA，Mun-bryce S，Wesley M，et al.Collagenase-induced intracerebral hemorrhage in rats［J］.Stroke，1990，21（5）：801-807.

［2］唐宇平，蔡定芳.急性腦出血損傷的病理生理學機制［J］.國外醫學：腦血管疾病分冊，2005，13（1）：11-15.

［3］Warach S.Editorial commen t-is there a perihematomal ischemic penumbra?More questions and an overlooked clue［J］.Stroke，2003，34（13）：1680-1683.

［4］Chen SH，Cheung RT.Neuropeptide Y and its receptor analogs differentially modulate the immunoreactivity for neuronal or endothelial nitric oxide synthase in the rat brain following focal ischemia with reperfusion［J］.J Biomed Sci，2005，12（2）：267-278.

［5］路長林.神經肽基礎與臨床［M］.上海：第二軍醫大學出版社，2003：128，188，449.

［6］Chen SH，Cheung RT.Intracerebroventricular injection of a neuropeptide Y receptor agonist increases while BIBP3226，a Y1 antagonist，reduces the infarct volume following transient middle cerebral artery occlusion in rats［J］.Neuroscience，2003，116（1）：119-126.

［7］南光賢，崔明姬，王利平，等.腦血管病患者血漿神經肽Y和神經降壓素濃度的測定及意義研究［J］.中風與神經疾病雜志，2005，22（2）：160-162.

［8］鄭吾最，鄭聲浩，林群力，等.高血壓腦出血患者血腫中NPY和CGRP對繼續出血及腦水腫的影響［J］.中風與神經疾病雜志，2001，18（3）：162-163.

［9］Bao L，Kopp J，Zhang X，et al.Localization of neuropep tide Y Y1 recep tors in cerebral blood vessels［J］.Proc Natl A cad Sci USA，1997， 94（23）：12661-12666.

［10］Prieto D，Simonsen U，N yborg NC.Regional involvement of an endothelium-derived contractile factor in the vasoactive actions of neuropeptide Yin bovine isolated retinal arteries［J］.Br J Pharmacol，1995，116（24）：2729-2737.

［11］Zukow ska-Grojec Z，Karwatow ska-Prokopczuk E，Rose W， et al.Neuropeptide Y：A novel angiogenic factor from the sympathetic nerves and endothelium［J］.Circ Res，1998，83（2）：187-195.

［12］Noll T，Hempel A，Piper HM.Neuropeptide Y reduces macromolecule permeability of coronary endothelial monolayers［J］.Am J Physiol，1996，271（5pt2）：1878-1883.