腎糖顆粒對糖尿病腎病大鼠療效的實驗研究*

傅曉駿 熊榮兵 張 婷

浙江中醫藥大學附屬金華中醫院（浙江金華321017）

糖尿病腎病（DN）是糖尿病的微血管病變，是影響患者生存質量和死亡率的重要因素。據統計，糖尿病腎病占糖尿病患者死亡率的60%。腎糖顆粒是金華市中醫院腎內科經過長期的臨床實踐總結出的治療早期DN的有效中藥復方［1］。我們從觀察DN臨床療效指標角度切入，通過本實驗來闡述本方對大鼠DN模型的療效。

1 材料與方法

1.1 動物健康雄性SD大鼠70只，清潔級，體質量（160±20）g，由上海中醫藥大學動物實驗中心代購并飼養，動物許可證號：SYSK（滬）-2009-0069。 在室溫（22±1）℃、相對濕度 55%±5%、光照周期12h環境中適應飼養1周后試驗。

1.2 試藥腎糖顆粒方：黃芪、水蛭粉。根據人-鼠劑量的換算，藥物經常規煎煮過濾，濃縮至每毫升含生藥2.33g，由金華市中醫院制劑室提供。鹽酸貝那普利片（產品批號：x1377，北京諾華制藥有限公司）。鏈尿佐菌素（美國Sigma公司）。血糖試紙（強生公司）。24h尿蛋白定量試劑盒（南京建成生物工程有限公司）。α1-MG試劑盒（北京北方生物技術研究所）。β2-MG試劑盒（原子高科股份有限公司）。尿白蛋白試劑盒，北京市福瑞生物工程公司。尿轉鐵蛋白、尿視黃醇結合蛋白試劑盒（上海麥約爾生物科技有限公司）。

1.3 造模SD大鼠適應性飼養1周后，隨機取8只為正常對照組，其余為模型組。模型組給予高脂飼料（10.0%豬油、10.0%蔗糖、2.5%膽固醇、0.4%膽酸鈉、77.1%基礎飼料）喂養，按文獻［2］腹腔注射STZ，每周1次，連續3周，造模完成72h后，經尾靜脈采血測血糖，血糖≥16.7mmol/L為糖尿病模型復制成功。1周后留取大鼠即刻尿，測尿微量白蛋白及尿肌酐，當模型組的尿微量白蛋白/尿肌酐顯著高于正常對照組，即為DN造模成功，不成功則剔除。

1.4 分組及給藥造模將成功的32只大鼠隨機分為4組，每組8只。正常對照組、模型對照組分別予以2mL的蒸餾水灌胃，中藥治療組予腎糖顆粒方煎液（每毫升含生藥量2.33g）2mL灌胃，西藥治療組予鹽酸貝那普利片（蒸餾水溶解，每毫升含鹽酸貝那普利藥量0.33mg）2mL，中西藥治療組予腎糖顆粒方煎液聯合鹽酸貝那普利片（蒸餾水溶解每毫升含生藥2.33g、鹽酸貝那普利0.33mg）混懸液2mL灌胃。連續給藥8周。實驗期間各組大鼠自由攝食、飲水。

1.5 指標檢測實驗灌胃8周后，即實驗結束前1d，金屬代謝籠收集大鼠的即刻尿及24h尿液，將所收集的尿液-70℃冰箱保存，檢測24h尿蛋白定量、尿肌酐、尿α1-MG、尿β2-MG、尿微量白蛋白、尿轉鐵蛋白（TRF）、尿視黃醇結合蛋白（RBP）。其中尿 α1-MG、尿β2-MG、尿微量白蛋白采用放射免疫方法，由上海曙光醫院同位素室代測。其余指標嚴格按試劑盒說明書操作完成。開始用藥前及治療結束后，尾靜脈采血，用血糖儀及血糖試紙測定血糖。

1.6 大鼠腎組織形態的觀察處死大鼠，無菌操作取腎，去掉包膜，矢狀線正中切開，所得腎臟用10%甲醛溶液固定，取小塊皮質，進行脫水包埋組織，連續切片，片厚4μm行HE染色。其步驟均按照說明書操作完成。并用DFC295攝像頭進行拍片觀察。

1.7 統計學處理各組數據均采用SPSS 13.0統計軟件進行處理，以（±s）表示，組內比較采用單因素方差齊性檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 一般情況在實驗過程中，正常對照組大鼠體質量增加明顯，精神狀態佳，反應靈敏，活動自如，毛色光澤，全部存活。模型對照組大鼠明顯消瘦，多飲，多食，多尿，且精神萎靡，反應遲鈍，活動緩慢，弓背蜷體，毛豎起無光澤，糞質稀溏，部分出現肢體及皮膚感染等合并癥。各治療組也出現上述表現及合并癥，但程度較模型對照組輕。

2.2 各組24h尿蛋白定量及血糖含量比較經8周治療后，模型對照組血糖明顯高于正常對照組（P＜0.01）；與模型對照組比較，各治療組血糖均顯著降低（P＜0.05）。治療后各組大鼠24h尿蛋白定量，模型組高于正常對照組，有顯著差異（P＜0.01）；各治療組均低于模型組（P＜0.05），但各治療組組間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。 見表 1。

表1 各組血糖、24h尿蛋白定量比較 ±s）

表1 各組血糖、24h尿蛋白定量比較 ±s）

與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。 下同。

組 別 n 血糖（mmol/L） 24h尿蛋白定量（mg/L）正常對照組 8 7.25±0.95** 13.01±3.72**模型對照組 8 32.38±1.26* 91.77±14.33△*中藥治療組 8 24.59±1.98* 53.42±24.35**西藥治療組 8 26.10±3.51* 54.10±22.14**中西藥治療組 8 23.32±5.62* 38.34±14.18**

2.3 各組尿微量白蛋白、α1-MG、β2-MG水平比較治療后各組大鼠尿微量白蛋白、α1-MG、β2-MG，模型對照組均高于正常對照組，有顯著差異（P＜0.01）；各治療組均顯著低于模型對照組（P＜0.05），各治療組之間比較差異均無統計學意義。見表2。

表2 各組尿微量白蛋白 α1-MG、β2-MG水平比較 （±s）

表2 各組尿微量白蛋白 α1-MG、β2-MG水平比較 （±s）

β2-MG（mg/L）正常對照組 8 341.73±65.66** 0.8633±0.11** 32.83±11.22**模型對照組 8 3008.93±156.24 1.40±0.24 74.61±13.21中藥治療組 8 1017.74±260.74* 1.00±0.16 39.99±10.56*西藥治療組 8 1034.18±686.93* 1.185±0.15* 45.89±6.81*中西藥治療組 8 565.53±105.56* 0.98±0.14* 51.73±12.99*組 別 n 尿微量白蛋白（ng/L）α1-MG（μg/mL）

2.4 各組 TRF、RBP水平比較治療后各組大鼠 TRF、RBP，模型組高于正常對照組（P＜0.01）；各治療組均低于模型對照組（P＜0.01）；各治療組間比較無統計學意義。見表3。

表 3 各組 TRF、RBP 水平比較 （μg/mL，±s）

表 3 各組 TRF、RBP 水平比較 （μg/mL，±s）

組 別 n 尿 TRF（μg/mL） 尿RBP（μg/mL）正常對照組 8 1.46±0.19** 575.94±160.87**模型對照組 8 17.67±4.72** 1579.50±190.80**中藥治療組 8 4.60±0.06** 895.25±247.76**西藥治療組 8 6.22±0.32** 1000.39±223.39**中西藥治療組 8 2.72±0.62** 884.60±81.40**

2.5 各組大鼠腎組織形態觀察見圖1。從圖1可以看到，與正常組大鼠比較，模型組大鼠的腎小球體積明顯增大，呈現腎小球肥大，并且有毛細血管腔狹窄及腎小囊粘連，腎小管上皮細胞空泡及顆粒變性，而治療組的中藥組、西藥組及中西藥組較模型組明顯改善，沒有明顯的球囊粘連，中藥組腎小管無上皮細胞空泡。同時治療組的大鼠腎小球體積較模型組也沒有明顯的增大。

圖1 各組大鼠腎組織形態學觀察（HE染色）

3 討 論

DN的原發病是糖尿病，屬于中醫學“消渴”范疇。消渴病日久及腎，易發生以下兩種病變：一是陰損及陽，陰陽俱虛，五臟虛弱，腎虛為主；二是久病入絡，且陰虛內熱，耗津灼液，而致腎絡瘀滯。因此，腎虛絡瘀是其基本病機特點，益氣活血通絡乃其治療關鍵。在前期臨床研究［1］中觀察發現，DN患者大多數有肢體麻木、刺痛、舌質紫暗、脈細澀等瘀血癥狀，提示DN患者體內存在瘀血現象。本課題腎糖顆粒方由黃芪和水蛭組成。方中黃芪性溫，有益氣、補虛、消腫的功效，而水蛭為傳統的破血、逐瘀、通經中藥。兩者合用旨在益氣活血化瘀通絡。大量的臨床和藥理研究證實，黃芪有抗血小板凝集，降低纖維蛋白原及全血黏度，增強腎血流量，改善內臟微循環的作用。而水蛭唾液中有一種抗凝血物質——水蛭素，能阻止凝血酶對纖維蛋白的作用，對糖尿病患者的高黏血癥療效確切［3］。水蛭還具有擴張毛細血管，增加外周血流量，改善缺血及抗血小板聚集和血栓形成的作用［4］。造模后，大鼠較正常組比較明顯消瘦，多飲，多食，多尿，且精神萎靡，反應遲鈍，活動緩慢，弓背蜷體，毛豎起無光澤，糞質稀溏，部分甚至出現肢體及皮膚感染等合并癥。這是DN虛證的典型表現。而經腎糖顆粒治療8周后，大鼠一般情況得到明顯改善，表明腎糖顆粒可改善DN大鼠的癥狀。實驗中還觀察到腎糖顆粒組大鼠的血糖、24h尿蛋白定量與模型組比較也明顯下降（P<0.05）。說明腎糖顆粒方還具降低血糖，降低24h尿蛋白定量，改善腎功能的作用，可有效的延緩DN大鼠的腎損傷。

Mongensen將1型糖尿病腎損害分為5期，其中微量白蛋白尿是診斷早期DN的主要指標，而出現持續性蛋白尿及臨床癥狀時，已達3級以上，腎病屬不可逆改變，已失去了預防和有效治療時機，故早期診斷治療十分重要。目前研究認識到糖尿病不僅會累及腎小球，而且還會累及腎小管間質結構，且腎功能惡化的程度與腎小管間質纖維化程度密切相關［5］。腎臟病的發生、發展、預后轉歸過程中，腎小管間質損害起著極其重要的作用［6］。尿微量白蛋白（mAlb）、TRF屬于腎小球性蛋白［6］，皆屬于低分子蛋白。在正常情況下，絕大部分的白蛋白、TRF均不能通過濾過膜，一旦腎小球損傷即可出現了腎小球性蛋白尿。α1-MG和β2-MG都是小分子量蛋白，能自由通過腎小球濾過膜濾入原尿，正常情況下，尿液中含量微乎其微。DN早期，當腎小管受損，重吸收功能減退時，尿α1-MG升高，且腎小管對α1-MG重吸收障礙先于β2-MG，在較寬的pH范圍內（4.0～10.0）較穩定，很少分解，而尿β2-MG不穩定，在酸性環境極易分解。因而尿α1-MG更能反映腎小管早期損傷，對早期DN的診斷價值更高，是極有價值的腎小管損傷標志性蛋白［8］。而尿視黃醇結合蛋白（RBP）是一種相對分子質量21kD的小分子蛋白質，當腎小管重吸收功能異常時，尿中RBP水平顯著增加。目前認為RBP是最敏感反映腎近曲小管損傷的指標。本實驗中不但模型組大鼠的尿微量白蛋白和TRF均顯著高于正常對照組；同時實驗結果還顯示模型組DN大鼠尿α1-MG、尿β2-MG及尿RBP較正常對照組比較均呈顯著升高。說明DN早期不僅存在腎小球損傷，產生了腎小球性蛋白尿，腎小管功能也受到一定程度破壞。通過治療干預8周后顯示，腎糖顆粒組DN大鼠尿微量白蛋白及TRF與模型組比較均分別呈顯著下降趨勢；同時腎糖顆粒組DN大鼠尿α1-MG、尿β2-MG及尿RBP較模型對照組比較也都顯著降低。由此表明腎糖顆粒方不僅扭轉了DN大鼠的腎小球病變，同時也在一定程度上改善了腎小管的重吸收功能，從而延緩了腎臟的進一步損傷。

有學者認為在DN早期階段進行有效干預治療，仍有希望防止DN向大量蛋白尿發展［9］。我們的實驗也證實了這一點。如前所述，本實驗通過腎糖顆粒方的干預有效地降低了DN大鼠的蛋白尿，改善了DN大鼠的一般狀況，從而延緩了DN微量白蛋白尿向大量蛋白尿的進展，延緩了腎損害。

［1］傅曉駿，張慧娥，劉繼紅，等.芪蛭合劑對早期糖尿病腎病治療作用的臨床研究［J］.中國中西醫結合腎病雜志，2004，5（9）：535-536.

［2］李璇，孫雪瑩，王瓊，等.鏈佐星-弗氏完全佐劑制作大鼠糖尿病腎病的模型［J］.南京中醫藥大學學報，2008，24（4）：257-260.

［3］姜底波，劉淑珍，馬立濤，等.水蛭對2型糖尿病高粘制血癥的治療作用［J］.中華內分泌代謝雜志，1999，15（2）：121.

［4］王雪英.水蛭地龍注射液治療糖尿病腎病血流變學的評價［J］.中國中西醫結合腎病雜志，2002，3（1）：47.

［5］Phillips AO，Steadman R.Diabetic nephropathy：the central role of renal proximal tubular cells in tubulointerstitial injury［J］.Histol Histopathol，2002，17（1）：247-252.

［6］楊春，許桂秋，張嶺.尿微量蛋白檢測對糖尿病腎病早期診斷臨床意義［J］.標記免疫分析與臨床，2002，9 （1）：56-57.

［7］邱清芳.尿微量蛋白檢測在高血壓腎損害早期診斷中的應用［J］.四川醫學，2002，23（7）：727.

［8］姚健.腎小管標記蛋白及其臨床意義［J］.中華腎臟病雜志志，1997，12（1）：13-15.

［9］石琳琳，張秀英，劉波，等.胰激肽原酶治療早期糖尿病腎病和臨床糖尿病腎病的治療比較［J］.吉林大學學報醫學版，2005，31（6）：934.