針刺對大鼠脊髓損傷后內源性神經干細胞的影響

劉麗霞 邰浩清 常加松 王長明

南京中醫藥大學（江蘇南京210046）

近年來已從成年大鼠的神經組織中分離培養出多潛能神經干細胞［1］，正常情況下，這些神經干細胞處于“靜止”或“休眠”狀態，在損傷等特定因素的作用下其分裂、分化的潛能被激活，從而出現增殖現象［2］。本實驗以針刺作為干預因素，應用免疫組化染色技術檢測巢蛋白（Nestin）、5-溴脫氧尿嘧啶核苷（Brdu）、神經元特異性烯醇化酶（NSE）和神經膠質原纖維酸性蛋白（GFAP）的表達，探討針刺對脊髓損傷后大鼠內源性神經干細胞的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組SD成年雄性大鼠，體質量250～300g，由南京中醫藥大學試驗動物中心提供。一抗Nestin、NSE和GFAP均為兔抗多克隆抗體（武漢博士德生物工程公司生產）；抗兔生物素二抗（南京凱基生產）。

1.2 分組與造模將SD大鼠隨機分為假手術組（5只）、模型組（10只）、針刺治療組（10 只）。 10g/L 戊巴比妥鈉（40mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠，俯臥位固定于手術臺上，備皮，常規消毒，無菌條件下縱行切開皮膚皮下組織，分離T9～T11棘突，切除椎板，暴露硬脊膜。假手術組徹底止血后逐層關閉切口；模型和針刺治療組采用改良Allen’s重物墜擊法，用10g自制重錘于2.5cm高度在玻璃導管引導下打擊開放的T10段脊髓，出現擺尾反射、雙后肢軀體回縮樣撲動即為造模成功，徹底止血后逐層縫合肌肉皮膚。各組術后1h予2萬U/kg青霉素腹腔注射，每日2次，連續3d。飼養于配有空調的專用室，自由飲食。每日膀胱區按壓排尿3次直至排尿反射恢復為止。

1.3 干預方式假手術組和模型組不予干預。針刺治療組大鼠取損傷平面上下各5個椎體的督脈穴和華佗夾脊穴，以毫針由上到下連續快速淺刺，不留針，每日1次。7d為1療程，共2個療程。

1.4 組織標本采集將Brdu溶于生理鹽水中，配置成1%的溶液，在處死動物前24h腹腔注射（50mg/kg），每8h注射1次，共3次，至相應時間點取材。4%多聚甲醛心臟灌注固定，在距離損傷中心5mm的頭側和尾側取材，梯度脫水，透明，石蠟包埋，制備5μm組織切片。

1.5 免疫組化染色切片脫蠟水化，檸檬酸緩沖液中進行微波抗原修復。3%H2O2消除內源性過氧化氫酶的作用，PBS洗3次，每次2min。封閉液10%山羊血清孵育10min，倒掉液體。分別加一抗 Nestin（1∶100）、Brdu（小鼠抗大鼠單克隆抗體，1∶100）、NSE（1∶100）、GFAP（1∶100），濕盒內孵育 30～60min，PBS 洗 3 次，每次2min，依次加入抗兔生物素化二抗（其中Brdu加入抗小鼠二抗）、鏈親和素標記HRP，各孵育10min，每步均用PBS洗3次，每次2min，DAB室溫顯色2～5min，蘇木素復染，鹽酸酒精分化，脫水，透明，封片，鏡檢。陰性對照用0.01mol/L的PBS代替一抗。采用形態學圖像分析軟件對組織切片進行圖像分析，每個標本隨機取4張切片，每張切片選取5個視野，以細胞內棕黃或棕褐色顆粒為陽性，對陽性細胞進行平均灰度和平均光密度的分析。

1.6 統計學處理應用SPSS 17.0統計軟件。數據以（±s）表示。先進行方差齊性檢驗，若方差齊同，組間比較采用單因素方差分析，各組兩兩比較采用LSD-t檢驗；若方差不齊，采用多個樣本比較的Kruskal-Wallis H檢驗，以Nemenyi法進一步檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

見表1、表2、圖1。模型組Nestin和Brdu的表達增加，與假手術組比較差異有統計學意義（P＜0.05）；而經過兩周針刺治療后，治療組Nestin和Brdu的表達更為明顯，與模型組比較其差異有統計學意義（P＜0.05）。針刺治療組NSE的表達增加明顯，與模型組比較差異有統計學意義（P＜0.05）；針刺治療組GFAP的表達較模型組為少，差異有統計學意義（P＜0.05）。

表1 各組大鼠Nestin、Brdu平均灰度和平均光密度比較 （±s）

表1 各組大鼠Nestin、Brdu平均灰度和平均光密度比較 （±s）

與假手術組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05。下同。

組 別 n 平均灰度 平均光密度 平均灰度 平均光密度假手術組 5 105.60±10.56 0.39±0.04 129.07±7.27 0.30±0.03模型組 10 85.01±12.39* 0.49±0.06* 104.13±8.67* 0.40±0.04*針刺治療組 10 70.15±5.26*△ 0.58±0.04*△ 94.77±7.10*△ 0.44±0.03*△Nestin Brdu

表2 各組大鼠NSE、GFAP平均灰度和平均光密度比較 （±s）

表2 各組大鼠NSE、GFAP平均灰度和平均光密度比較 （±s）

組 別 n 平均灰度 平均光密度 平均灰度 平均光密度假手術組 5 81.04±12.83 0.52±0.07 85.40±7.74△△ 0.50±0.04模型組 10 111.59±9.30* 0.37±0.04* 60.31±4.80*△ 0.66±0.03*針刺治療組 10 95.76±7.52*△ 0.43±0.04*△ 71.20±7.57*△ 0.58±0.05*△NSE GFAP

圖1 針刺治療組陽性細胞表達圖（×400）

3 討 論

成年哺乳動物終生保留有處于“靜止”狀態的ENSCs，在某些因素作用下或者受損傷刺激時可被激活，重新進入細胞增殖周期前進一步分化為特定功能的神經細胞［3］。脊髓損傷后ENSCs存在的微環境更適合于膠質細胞的分化，如果能夠定向調控ENSCs向神經元分化，減少組織屏障的形成，將可能達到利用ENSCc促進神經通路的重建，進而治療脊髓損傷的目標［4］。

Nestin是一種中間絲蛋白，存在于神經上皮前體細胞［5］，也存在于成年多能干前體細胞［6］，為ENSCs的常用標志。Brdu是一種胸腺嘧啶脫氧核苷類似物，在細胞增殖周期的S期嵌入細胞核的DNA，可用來標記具有增殖活性的細胞［7］。神經元特異性烯醇化酶（NSE）和神經膠質原纖維酸性蛋白（GFAP）分別作為神經元和星形膠質細胞的標志。本實驗研究結果顯示，針刺治療組Nestin和Brdu的表達較損傷組更加明顯，說明針刺作用于損傷后的微環境放大了促內源性神經干細胞增殖分化的效應；針刺治療組的NSE表達較之損傷組為多，而GFAP的表達卻比損傷組要少，表明針刺更傾向于誘導ENSCs向神經元分化。但是本實驗沒有涉及到ENSCs的定位和遷移，實驗動物樣本數少，觀察時間短，有待于今后繼續的探索研究。

針刺通過何種機制誘導ENSCs增殖分化形成神經元還不清楚。以往研究顯示針刺治療可以增加促脊髓損傷修復的神經營養因子及相關蛋白的表達：如腦源性神經營養因子［8］（BDNF）、神經生長因子［9］（NGF）、成纖維細胞生長因子［10］（FGF）、層黏蛋白［11］（LN）、生長相關蛋白-43［12］（GAP-43）等；而針刺也可以干預神經生化因素，比如降低nNOSmRNA、iNOSmRNA的表達，降低NOS的活性［13］，也可以阻斷β-EP合成釋放，對抗β-EP對脊髓繼發損傷［14］。實驗顯示上述一些因子，如FGF-2能促進脊髓損傷后大鼠脊髓內ENSCs的增殖［15］。因此我們推測針刺可能是通過改變脊髓損傷微環境中的神經營養因子和相關蛋白等物質，從而誘導ENSCs增殖分化形成神經元。進一步探討針刺對脊髓損傷修復的分子機制，需要后續更加深入的研究。

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