天花粉對腦缺血再灌注大鼠高同型半胱氨酸血癥的影響

陳 威 王 紅 張思為

暨南大學第二臨床醫學院（廣東深圳518020）

研究表明，高同型半胱氨酸血癥（Hhcy）可能是繼高血壓、高血脂、糖尿病、心臟病等傳統缺血性腦血管病發病的危險因素外一個新的獨立危險因素［1］。筆者采用大鼠大腦中動脈栓塞（MCAO）建立局灶性腦缺血再灌注（CIR）損傷模型，觀察天花粉對Hhcy大鼠CIR后細胞周期蛋白A（cyclinA）表達的影響，探討養陰法對缺血后神經元損傷的保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料健康成年雄性SD大鼠72只，體質量200～250g，由廣東省實驗動物中心提供。天花粉精制液、補陽還五湯精制液，質量濃度為1.0g/mL（深圳市人民醫院制劑中心制備）。

1.2 模型制作SD大鼠隨機分為假手術、模型組、天花粉組、補陽還五湯組，每組各18只。各組根據缺血再灌注時間分為12、24、48h 3個亞組。線栓直徑為0.22～0.25mm的釣魚線，將一端輕輕沾上硅膠作成線栓頭（直徑約為0.28～0.30mm），陰干后用刻度尺測量距線栓頭18mm及20mm處用記號筆標記記號，將線栓置于75%酒精中備用。參考Zea Longa［2］的模型制作方法進行造模。大鼠用10%水合氯醛（350mg/kg）腹腔注射麻醉，分離左側頸總動脈、頸外動脈、頸內動脈和翼腭動脈。結扎翼腭動脈，然后在距頸總動脈分叉1cm處結扎頸外動脈，并于距結扎處近端約0.5cm處遠心端用電凝器灼斷之。動脈夾夾閉左頸總動脈，在頸外動脈剪一切口，將一長5cm，直徑0.126mm尼龍線經左側頸外動脈主干切口緩慢向頸內動脈入顱方向推進，以頸總動脈分叉處為標記，推進18～20mm感到輕微阻力時，即阻斷大腦中動脈，將線拴系緊防止滑出。阻斷3h后，撥出尼龍線至有輕微阻力時止，此時血流灌注成功，完成腦缺血再灌注損傷模型。假手術組除不插線外，全過程同其他各組。造模成功率為75%，死亡后補充動物。

1.3 給藥方法實驗前7d稱取體質量后灌胃，2mL/100g，每日2次，分別在上午8：30和下午5：00進行。假手術組予生理鹽水，模型組、天花粉組及補陽還五湯組以L-蛋氨酸1g/（kg·d）灌胃，天花粉組和補陽還五湯組分別給相應藥液。采用盲法給藥，給藥由專人負責，造模者回避。

1.4 神經病學評分標準各組動物在12、24、48h各個時間點處死前按照Longa的5分法評分標準進行［2］：無神經缺損為0分；提尾時左前肢內收，不能完全伸直為1分；行走向左傾倒為2分；向左旋轉為3分；不能自己行走或昏迷為4分。1～4分為有效模型。

1.5 血漿中Hcy含量檢測各組大鼠在不同時間點抽血2mL，置含有20g/L乙二胺四乙酸二鈉100mL的一次性試管中，離心分離出血漿標本置70℃保存，待標本收集全后，應用高效液相色譜法檢測血漿Hcy。

1.6 免疫組化測定分別于腦缺血再灌注12、24、48h各時間點用10%水合氯醛（0.35mL/100g）麻醉大鼠，4%的多聚甲醛灌注固定后斷頭取腦，于4%的多聚甲醛中浸泡24h，自視交叉向前后2mm切取冠狀腦片，取第3片行石蠟包埋，連續切片。石蠟切片脫蠟水化；用檸檬酸緩沖液（pH6.0）微波修復20min。滴加 50μL的兔多克隆 cyclin A 抗體（1∶100），置濕盒中 4℃過夜；沖洗后滴加50μL聚合物增強劑，室溫下孵育20min；沖洗后滴加50μL酶標抗兔聚合物，室溫下孵育50min；沖洗后DAB鏡下顯色2～3min。陰性對照：用PBS代替兔多抗，其余步驟同前。陽性對照：應用腸癌石蠟切片制作陽性對照片，其余步驟同前。

1.7 統計學處理有關變量用（±s）表示，數據統計分析采用雙因素方差分析，整體上考察藥物處理因素與時間因素對結果的影響有無交叉，再通過單因素方差分析對各個時間點數據進行分析。單因素方差分析兩兩比較，如果尚不能確認方差不齊，則采用Bonferroni檢驗，如果已經確定方差不齊，則采用Tamhane’s T2檢驗。使用SPSS 13.0軟件進行統計分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組神經功能評分比較見表1。神經學癥狀評分時間因素與藥物分組因素之間不存在交互作用。與模型組比較，天花粉組、補陽還五湯組神經功能得到顯著改善（P＜0.05或0.01）；天花粉組、補陽還五湯組之間差別不明顯（P＞0.05）。

表1 各組不同時間點神經功能評分（分，±s）

表1 各組不同時間點神經功能評分（分，±s）

與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。 下同。

組 別 n 再灌注12h再灌注24h再灌注48h藥物主效應假手術組 18 0 0 0 0模型組 18 3.17±0.75 2.83±0.75 2.67±0.52 2.89±0.68補陽還五湯組 18 2.67±0.82* 2.33±0.52*2.17±0.41* 2.38±0.61*天花粉組 18 2.50±0.84**2.17±0.75**1.83±0.75**2.16±0.79**

2.2 各組血漿中Hcy含量比較見表2。血漿中Hcy含量時間因素與藥物分組因素之間存在交互作用。與模型組比較，天花粉組、補陽還五湯組Hcy含量減少（P＜0.05或0.01）；缺血再灌注24h，天花粉組與補陽還五湯組比較也顯著減少（P＜0.05）。

表2 各組不同時間點血漿Hcy含量比較（μmol/L，±s）

表2 各組不同時間點血漿Hcy含量比較（μmol/L，±s）

與補陽還五湯組比較，△P＜0.05。下同。

組 別 n 再灌注12h 再灌注24h 再灌注48h假手術組 18 3.67±1.17 3.02±0.88 3.09±0.82模型組 18 19.92±2.31 37.39±2.91 36.35±1.12補陽還五湯組 18 10.84±1.09* 18.80±1.47* 16.94±1.17*天花粉組 18 10.40±1.32** 15.22±1.25**△ 15.01±1.55**△

2.3 各組cyclin A表達比較見表3。cyclin A陽性細胞數時間因素與藥物分組因素之間存在交互作用。缺血再灌注各時間點，與模型組比較，天花粉組、補陽還五湯組陽性細胞數顯著減少（P＜0.05或0.01）；缺血再灌注24h和缺血再灌注 48h，天花粉組與補陽還五湯組比較也顯著減少（P＜0.05）。

表3 各組不同時間點cyclinA陽性細胞數比較 （±s）

表3 各組不同時間點cyclinA陽性細胞數比較 （±s）

組 別 n 再灌注12h 再灌注24h 再灌注48h假手術組 18 3.11±1.45 3.28±1.40 2.0±1.03模型組 18 25.67±3.74 34.67±3.34 28.53±4.85補陽還五湯組 18 17.67±2.27* 20.16±3.38* 19.00±0.84*天花粉組 18 16.33±1.28** 16.0±2.45**△ 16.47±3.10**△

3 討 論

中風的病機以氣虛血瘀、阻滯脈絡為主，本研究表明尚存在陰津虧虛。津血同源同行，津榮則血旺、津運則血暢，若陰津不足，脈道枯澀，則脈絡瘀阻，產生瘀血，痹阻于腦絡，發為中風。故本研究重用養陰藥天花粉，滋補陰液、增水行血、濡潤脈道，以利血行，從而達到防治缺血性中風的目的。

腦缺血再灌注損傷是指腦缺血恢復血液灌注后，腦細胞損傷反而進行性加重的過程。在此過程中Hhcy可能加重腦細胞損傷。目前研究發現，Hhcy對腦梗死影響的機制主要為（1）Hhcy對血管內皮結構和功能的影響。血管內皮細胞對調節和維持血管系統的正常功能起著重要作用。內皮細胞為覆蓋在血管內表面的單層扁平細胞，正常內皮細胞既是感應細胞又是效應細胞，能感知血液中的炎癥信號、激素水平、切應力、血壓等信息。在感知物理和化學因素刺激后，可合成和分泌多種血管活性物質，如內皮衍生的松弛因子（EDRF）、前列腺素 （PGs）、內皮素 （ET）、血管緊張素Ⅱ、血栓素 A2（TXA2）等，這些活性物質對血管舒縮功能的調節、凝血和抗凝血都有重要的作用。內皮細胞的損傷在動脈粥樣硬化（AS）的形成過程中具有重要的始動作用。Hhcy可能通過氧化應激機制導致內皮細胞出現壞死、凋亡等損傷改變。有研究認為，Hhcy可通過細胞內外濃度梯度和轉運裝置被動或主動地轉運到細胞內，通過巰基發生自氧化，產生過氧化氫、羥自由基 （·OH）、超氧陰離子等，發生氧化應激反應。當金屬離子鐵、銅存在時，Hcy產生具有強烈細胞毒性的OH-OH-可作用于細胞膜內不飽和脂肪酸，啟動膜脂質過氧化鏈式反應，造成血管內皮細胞凋亡，功能喪失，導致動脈硬化［3］。Hcy是一種炎癥刺激物，它可以刺激內皮細胞產生多種趨化因子和黏附分子損傷內皮細胞，導致動脈粥樣硬化發生。在病理情況下，VCAM-1在內皮細胞表面表達異常增多。LiM等［4］也證實Hcy能促進內皮細胞表達和分泌VCAM-1，導致血管炎性損傷。（2）Hhcy促進血小板聚集，Hcy可抑制內皮細胞 ADP酶的活性，致使二磷酸腺苷（ADP）降解減少，凝血酶和 ADP可以改變花生四烯酸的代謝，促進 TXA2合成增多，引起血小板聚集，血小板在內皮細胞的黏附和聚集也是促進凝血過程瀑布反應的重要因素［5］。（3）Hhcy還可分別增加cyclin D和cyclin A的信使核糖核酸（mRNA）水平3倍和15倍，提示Hhcy誘導的cyclin的mRNA合成，對鼠主動脈平滑肌細胞由靜止期進入增殖期起主要作用。cyclin A蛋白是細胞周期由G1期向S期轉變過程中的一種重要調節蛋白，它的表達標志著細胞周期進入到G1晚期或G1晚期的機制激活。

本實驗中，與模型組比較，天花粉組、補陽還五湯組各時間點血漿Hcy顯著降低，表明天花粉及補陽還五湯均能減少血漿Hcy，從而達到減輕腦缺血再灌注損傷的作用。腦缺血再灌注損傷能夠誘導Hhcy的出現，從而刺激大鼠腦內的神經元異常表達cyclin A蛋白，加重腦細胞的損傷，天花粉及補陽還五湯均可減少cyclin A蛋白的表達，其機制可能是通過減少血漿Hcy的含量。

［1］Mcllroy SP，Dynan KB，Laws on JT，et al.Moderately elevated plasma homoxysteine，methylenetetra，hydrofolate reductase genotype，and risk for stroke，vascular demention and Alzheimer disease in Northern Ireland［J］.Stroke，2002，33（10）：2351.

［2］Bederson JB，Pitts LH，Tsuji M，et al.Rat middle cerebral artery occlusion：evaluation of the model and development of a neurologic examination［J］.Stroke，1986，17（3）：472.

［3］Dayal S，Arning E，Bottiglieri T，et al.Cerebral vascular dysfunction mediated by superoxide in hyperhomocysteinemic mice［J］.Stroke，2004，35 （8）：1957.

［4］Li M，Chen J，Li YS，et al.Folic acid reduces adhesion molecules VCAM-1 expession in aortic of rats with hyperhomocysteinemia［J］.Int J Cardiol，2006，106（2）：285.

［5］Dardik R，Varon D，Tamarin I，et al.Homocysteine and oxidized low density lipoprotein enhanced platelet adhesion t o endothelial cells under flow conditions；distinct mechanisms of thrombgenic modulation［J］.T Hromb Haenost，2000，83（5）：338.